Die zwei Säulen von Flow-FISH

Flow-FISH basiert auf zwei wichtigen Säulen: Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) und Durchflusszytometrie. Grundlage der FISH sind spezifische, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte DNA-Oligonukleotide (sog. Gensonden). Sobald sie durch einfache Diffusionsprozesse in die Bakterienzellen eingebracht sind, binden sie an ihre spezifischen rRNA-Zielorte innerhalb der Bakterienspezies. Diese Zielorte innerhalb der Ribosomen spiegeln die Phylogenie der Bakterien wider und ermöglichen eine spezifische Identifizierung, da die Sonden nur an die Bakterien binden, für die die Oligonukleotide entwickelt wurden. Nach Anregung mit Licht einer definierten Wellenlänge beginnen die Zellen zu leuchten und können identifiziert werden. Da die spezifischen Oligonukleotide an rRNA-Zielstellen binden, werden auch nur lebende Zellen detektiert, da nur diese genügend Ribosomen besitzen, um ein Fluoreszenzsignal abzugeben. [3], [4], [5], [6]

Bild 2: Ergebnisse aus einem Methodenvergleich an zwei Einsatzbeispielen. © vermicon

Diese Informationen sind äußerst wertvoll für die Beurteilung der Effizienz des Produktionsprozesses und der Qualität des probiotischen Produkts. Unternehmen können die Flow-FISH-Methode sowohl als Dienstleistung nutzen als auch mit kommerziellen Testkits, die auf bestimmte probiotische Bakterien abzielen, anwenden. Die hohe Empfindlichkeit und Spezifität der Methode ermöglichen eine präzise Überwachung der Bakterienpopulationen während des gesamten Produktionsprozesses, von den Rohstoffen bis zum Endprodukt. Herkömmliche Methoden der Plattenzählung können eine geringere Zahl an lebensfähigen Zellen ergeben als tatsächlich vorliegt, da lebensfähige, aber nicht kultivierbare Zellen vorhanden sind. Diese metabolisch aktiven Zellen können zur probiotischen Wirkung beitragen, bilden aber keine Kolonien auf Agarplatten. Flow-FISH erfasst auch diese, indem es auf ihre rRNA abzielt und eine Darstellung der lebensfähigen Zellzahlen liefert. [1], [2]

Und Probiotika-Produkte enthalten oft mehrere Bakterienarten, die jeweils einzigartig zu spezifischen gesundheitlichen Vorteilen beitragen. Flow-FISH ermöglicht die spezifische Identifizierung und Quantifizierung jeder Art innerhalb der Mischung, um sicherzustellen, dass das Produkt seinen Etikettenangaben entspricht.

In der veröffentlichten Validierungsstudie wurde Flow-FISH zur Analyse lyophilisierter Proben von Lacticaseibacillus rhamnosus, Lactiplantibacillus plantarum und Bifidobacterium animalis subsp. lactis sowie eines kommerziellen Probiotika-Produkts angewendet (siehe Bild 2).

Forschung und Entwicklung

Die Anwendung von Flow-FISH in der probiotischen Industrie kann für die Forschung und Produktentwicklung genutzt werden. Die Daten über Anzahl lebensfähiger Zellen und Artenzusammensetzung können verwendet werden, um probiotische Formulierungen zu verbessern bzw. zu optimieren.

Forschende im Bereich der Mikrobiologie und Probiotika können Flow-FISH für detaillierte Studien zur Lebensfähigkeit und zu den Wechselwirkungen probiotischer Bakterien nutzen. Die Fähigkeit der Methode, zwischen verschiedenen Arten innerhalb einer Mischung zu unterscheiden, kann tiefe Einblicke in mikrobielle Dynamiken und deren gesundheitliche Auswirkungen liefern.

Zusammenfassung

Die Entwicklung und Implementierung von Flow-FISH stellt einen großen Fortschritt im Bereich der Mikrobiologie und Probiotika dar, nicht nur in Bezug auf Genauigkeit und Zuverlässigkeit der Zählung lebensfähiger Zellen, sondern auch in Bezug auf die gesamten Qualitätskontrollprozesse in der Probiotika-Industrie. Herstellern ermöglicht Flow-FISH die direkte Überwachung probiotischer Kulturen während der Produktion, um sicherzustellen, dass das Endprodukt den spezifizierten Qualitätsstandards entspricht. Forschende können die Methode zu Studien nutzen, z. B. für die Untersuchung des menschlichen Darmmikrobioms und seiner Wechselwirkungen mit probiotischen Produkten.

Literatur
[1] Davis, C. (2014). Enumeration of probiotic strains: review of culture-dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria. Journal of Microbiological Methods, 103, 9–17.

[2] Snaidr L, Mühlhahn P, Beimfohr C, Kreuzer C, Richly C and Snaidr J (2024). Specific cultivation-independent enumeration of viable cells in probiotic products using a combination of fluorescence in situ hybridization and flow cytometry. Front. Microbiol. 15:1410709. doi:10.3389/fmicb.2024.1410709

[3] Amann, R., Binder, B., Olson, R., Chisholm, S., Devereux, R., and Stahl, D. (1990). Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. Applied and Environmental Microbiology, 56(6), 1919–1925.

[4] Amann, R., and Fuchs, B. M. (2008). Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology, 6(5), 339–348.

[5] Snaidr, J., Fuchs, B., Wallner, G., Wagner, M., Schleifer, K., and Amann, R. (1999). Phylogeny and in situ identification of a morphologically conspicuous bacterium, Candidatus Magnospira bakii, present at very low frequency in activated sludge. Environ. Microbiol. 1, 125–135.

[6] Woese, C. R. (1987). Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51, 221–271.

[7] Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., and Nalbant, A. (2017). Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology, 37(2), 163–176.

AUTORIN
Laura Snaidr
vermicon AG, Hallbergmoos
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