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C18-Phasen in der HPLC - Arbeitspferde zwischen Dauergalopp und Kollaps

C18-Phasen in der HPLCArbeitspferde zwischen Dauergalopp und Kollaps

C18-Säulen gelten als bestens etablierte Allrounder der Flüssigkeitschromatographie. Trotz großer Ähnlichkeiten können sie sich bei näherer Betrachtung im Detail doch erheblich unterscheiden. Sie sind für RP-Trennungen universell einsetzbar und haben sich als sehr robust erwiesen. Aber im Extremfall können sie auch kollabieren.

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Selektivitätsunterschiede verschiedener C18-Produkte

Der LC-Säulenmarkt wird von Reversed-Phase-Materialien (RP-Phasen; modifiziertes Silicagel mit C8, C18, Phenyl etc.) beherrscht, wobei C18-Phasen (Synonyme: Octadecyl, ODS, OctaDecylSilyl) in großem Umfang dominieren. Bisher wurden schätzungsweise rund 800 unterschiedliche C18-Säulen auf den Markt gebracht (1).

Unter HPLC-Einsteigern ist die Ansicht weit verbreitet, dass sich C18-Phasen so ähnlich sind, dass sie sich in der Praxis gleich verhalten müssten. Das ist jedoch eine sehr grobe Vereinfachung, die einer genaueren Betrachtung nicht standhalten kann. Vielmehr gilt das Motto: Manche sind „gleicher“.

Das liegt alleine schon daran, dass die Säulen der jeweiligen Hersteller einerseits auf Silica-Materialien aus unterschiedlichen Quellen basieren, und andererseits erfolgen die Modifikationen der Oberflächen mit teilweise völlig unterschiedlichen Methoden und Reagenzien. Daraus ergibt sich eine Vielzahl von Detailunterschieden, die seitens der Hersteller sogar erwünscht sind, um eine gewisse Bandbreite an Selektivitäten anbieten zu können. Insbesondere für weit verbreitete, genau definierte Applikationen werden spezielle C18-Phasenadaptierungen angeboten. Deren Selektivität wird für den vorgegebenen Umfang an Zielanalyten „maßgeschneidert“ und an vorbestimmten Trennanforderungen (gesetzliche Vorgaben, Normen, Richtlinien, etc.) ausgerichtet (z.B. PAK-Säulen).

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Waters® Reversed-Phase Column Selectivity Chart

Detailunterschiede mit großen Auswirkungen
Zur Visualisierung der feinen, aber entscheidenden C18-Unterschiede wurden in Bild 1 vier Analyten unter denselben chromatographischen Bedingungen (Laufmittel, Temperatur, etc.) mit vier unterschiedlichen C18-Phasen desselben Herstellers analysiert und gegenübergestellt. Die erwünschten Selektivitätsunterschiede werden besonders anhand der Analyte 2 und 3 ersichtlich, welche entweder gut getrennt sein können, zusammenfallen oder sogar die Reihenfolge wechseln.

Die Anordnung der Chromatogramme von oben nach unten entspricht bei dieser Anwendung auch der Empfehlung an den Analytiker. Die „Eclipse Plus C18“ wäre für diese Trennaufgabe die erste Wahl, dicht gefolgt von „StableBond SB-C18“. Die anderen beiden Varianten lösen Analyt 2 und 3 zu schlecht bzw. gar nicht auf.

Die Bandbreite an Eigenschaftsunterschieden innerhalb der C18-Familie lässt sich auch mit dem Software-Tool „Waters® Reversed-Phase Column Selectivity Chart“ bildlich veranschaulichen. Die Fa. Waters hat für viele gängige LC-Phasen relevanter Hersteller Selektivitäts-Kennzahlen und die Hydrophobizität ermittelt und stellt sie in einem Diagramm gegenüber. Alle RP-Phasen aller Hersteller sind in Bild 2 als rote Punkte dargestellt. Die Hervorhebung der gängigsten C18-Phasen als große schwarze Punkte zeigt, wie stark die Unterschiede alleine innerhalb der C18-Gruppe ausfallen können. Die Darstellungsweise der Software soll es übrigens einfacher machen, eine Säule durch eine ganz ähnlich auftrennende zu ersetzen. Dazu wird jene Phase ausgewählt, deren Punkt im Chart möglichst nahe neben der zu substituierenden liegt. Die Software ist kostenfrei als iPad-App erhältlich und auch online nutzbar unter: http://www.waters.com/waters/promotionDetail.htm?id=10048475&locale=de_AT

Suchergebnis der kostenlosen USP-PQRI Online-Datenbank

Eine weitere kostenlose Möglichkeit, Säulen möglichst gleicher Selektivität von verschiedenen Herstellern zu finden, bietet die Online-Datenbank der Nonprofit-Organisation U.S. Pharmacopeial Convention (USP). Dafür ist eine kurze, kostenfreie Registrierung (unter http://www.usp.org) notwendig, die allerdings nach zehn Tagen reaktiviert werden muss.

Die Phasen-Datenbank wurde von der USP Working Group on Column Equivalency im laufe der letzten zehn Jahre entwickelt, in der praktisch alle relevanten Säulenhersteller vertreten sind. Sie greift auf fast 3 000 Retentionszeitmessungen von 150 Testverbindungen auf 100 verschiedenen Säulen zurück und beschreibt die Eigenschaften der Einträge mit den sechs Parametern H „hydrophobicity“, S „steric interaction“, A „hydrogen-bond acidity“, B „hydrogen-bond basicity“, und C „ion-exchange capacity“ (für pH 2,8 und pH 7,0), welche in der Ähnlichkeitstabelle (Bild 3) angeführt werden.

Beim Suchbeispiel in Bild 3 soll die mit Rank = 0 bezeichnete Säule ersetzt werden, worauf das Programm durch Vergleich mit den hinterlegten Phasen die 10 passendsten Alternativen ausgibt. Der F-Wert in der 2. Spalte ist die entscheidende Kennzahl, die mit zunehmender Ähnlichkeit immer kleiner wird. Bei F < 3 ist die Wahrscheinlichkeit für übereinstimmende Trennungen relativ groß. Detaillierte Erläuterungen über die Erstellung der Daten zu den hinterlegten Phasen (2), Parametern (3) und insbesondere zur genauen Vorgangsweise bei der Suche nach Phasenalternativen finden sich auf der Homepage von http://www.usp.org.

Schematische Darstellung einer Pore eines LC-Partikels

Kollaps der RP-Phase
C18-Phasen kann man sich stark vereinfacht als ein polares Trägermaterial (Silicagel) mit einer dichten „Behaarung“ an unpolaren C18-Ketten vorstellen, die mit einem Eluenten interagieren, der aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel (Methanol, Acetonitril, etc.) zusammengesetzt ist. In Bild 4 sind die nicht abgedeckten, endständigen, polaren OH-Gruppen rot dargestellt, der mobile Eluent in hellgrün.

Solange immer ein organischer Mindestanteil von ca. 10 % anwesend ist, funktioniert die chromatographische Trennung wie geplant, da der hydrophobe C18-Teil den unpolaren, organischen Eluentenanteil bevorzugt. Es gibt aber auch spezielle Anwendungen, bei denen ein Eluent aus 100 % Wasser vorteilhaft wäre. Z.B. wenn sehr polare Analyten reteniert werden sollen, die schon bei geringen organischen Zusätzen schnell eluieren. Besonders bei sehr hydrophoben Phasen mit hoher Strukturdichte an chemisch gebundenen Alkylketten bzw. bei RP-Phasen, die ein hohes sog. Endcapping mit unpolaren Silanisierungs-Reagenzien aufweisen, kann bei einem ausschließlichen Wasser-Eluenten Folgendes passieren: Die C18-Bürsten werden nicht mehr benetzt, wenn der Eluent nicht zumindest 5 % organischen Anteil enthält. Die unpolaren Ketten werden sozusagen aus der wässrigen Phase hinausgedrängt und schmiegen sich aneinander. Man spricht dann vom Kollabieren der Phase, weil die C18-Bürsten nicht mehr wie Haare in die umgebende Flüssigkeit stehen, sondern quasi umfallen, um sich übereinander zu legen. Eigentlich handelt es sich dabei eher um ein „Entnetzen“ der Phase (sogenanntes Dewetting), als Gegensatz zum Benetzen, welches für einen ordentlichen Chromatographieprozess unbedingt notwendig ist (1).

Eine Erklärung dafür könnte folgende sein: Die Interaktion mit der stationären Phase findet überwiegend innerhalb der Poren (Bild 4) statt und weniger an der äußeren Oberfläche der Partikel. Im Normalfall, das heißt bei einem organischen Anteil von mindestens 10  % sind diese Poren vollständig mit dem Eluenten gefüllt und die C18-Ketten bleiben gut solvatisiert. Bei 100 % Wasser kann es allerdings im Extremfall sogar zu einem Verdrängen des Wassers aus den Partikelporen kommen, wodurch die oben genannte Entnetzung für alle C18-Ketten in dieser Pore eintritt. Dafür gibt es auch eine mechanische Erklärung: Beim Umschalten auf einen Organik-freien Eluenten wird das Wasser unter dem starken Druck der LC-Pumpe in die Poren der Trennpartikel gedrückt, obwohl es von der mit hydrophoben Gruppen (C-18 Ketten) überzogenen Oberfläche eigentlich abgestoßen wird. Das Wasser füllt zwar die Pore, kann aber nicht in die stark unpolare Oberflächenbelegung eindringen. Sobald der Druck nachlässt (Abschalten der LC-Pumpe; bei älteren Systemen zum Teil auch schon bei einem ausgeprägten Druckabfall durch Schaltvorgänge bei der Injektion), kann das Wasser durch den Abstoßungseffekt der stationären Phasenoberfläche sogar aus der Pore gedrückt werden. Dieser Dewetting-Prozess kann durch erneuten Druckaufbau mittels LC-Pumpe nicht wieder vollständig rückgängig gemacht werden und die Retention bleibt viel geringer und meist auch stark schwankend. Eine Regenerierung solcher Säulen kann durch langes Spülen (mindestens 20-faches Säulenvolumen) mit ca. 10 % Acetonitril oder 10 % Methanol versucht werden. Der Druck sollte dabei im oberen zulässigen Bereich gehalten werden, um alle entnetzten und „trockenen“ Porenstellen zu erreichen.

Diese Gefahr für ein „Entnetzen“ der Phase besteht weniger bei RP-Phasen, welche polare funktionale Gruppen nahe der Oberfläche besitzen. Aber auch sehr kurzkettige Phasen wie C2 kennen dieses Problem nicht, da die immer vorhandenen freien OH-Gruppen des Grundmaterials nur zum Teil abgedeckt werden und ungehindert mit dem Wasser interagieren können. Auch sehr große Porendurchmesser (300  Å) stehen dem Dewetting-Effekt entgegen, da sie für die Verdrängung von H2O scheinbar schon zu groß sind (1).

Die Trennaufgabe für polare Analyten lässt sich übrigens besser mit Phasen lösen, welche für den Betrieb mit 100 % Wasser (bzw. Gradienten mit langen Wasserphasen) konzipiert wurden. Das können RP-Phasen sein, die durch Oberflächenmodifikationen weniger hydrophob sind, polare Gruppen enthalten („Polar Embedded“) oder zum Typ „Mixed Mode“ gehören. Alternativ zu C18 stehen für derlei Trennaufgaben auch Entwicklungen wie HILIC (Hydrophilic Interaction Chromatography) oder SHARC™ (Specific Hydrogen-bond Adsorption Resolution Column) zur Verfügung.

Fazit
Abschließend darf zusammengefasst werden, dass sich als C18-Phasen bezeichnete LC-Trennmaterialien in bestimmten Details soweit unterscheiden können, dass diese Differenzen durchaus über den Trennerfolg entscheiden können. Das erschwert zwar den 1:1-Ersatz von solchen Phasen, erhöht aber auch die Chance, dass ein Trennproblem durch Austausch gegen andere C18-Produkte besser gelöst werden kann.

Die Vielfalt an C18-Phasenvarianten eröffnet in Kombination mit verschiedenen Eluentengemischen ein umfangreiches Repertoire an Problemlösungsmöglichkeiten für nahezu jede Trennaufgabe.

Literatur
[1] Ronald E. Majors; „The Top 10 HPLC and UHPLC Column Myths: Part 1“;LC*GC Europe; S584-592; 2013.
[2] http://www.usp.org/pqri-approach-column-equiv-tool.
[3] http://apps.usp.org/app/USPNF/columnsGlossary.html#A.

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik, A-4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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