Über die Entwicklung einer Methode

Serielle RPLC-HILIC-Kopplung mit hochauflösender MS

Seit mehr als zehn Jahren wird die serielle Kopplung von RPLC- und HILIC-Säulen – Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RPLC) und hydrophile Interaktions-Flüssigkeitschromatographie (HILIC) – in Kombination mit hochauflösender massenspektrometrischer Detektion (HRMS) eingesetzt. In dieser Zeit wurden mehrere Studien veröffentlicht, in denen diese chromatographische Methode in unterschiedlichen Bereichen wie Umweltanalytik (z. B. wässrige Proben), Lebensmittelanalytik (z. B. Trinkwasser und andere Getränke), (pflanzliche) Stoffwechselanalytik, Prozessüberwachung (z. B. verschiedene Oxidationsverfahren) und anderen zum Einsatz kam.

Dieser polaritätserweiterte chromatographische Ansatz ermöglicht die Trennung von unpolaren, polaren und sehr polaren Molekülen in einem einzigen Lauf. Nun wurde ein aktualisierter serieller Aufbau mit (U)HPLC-Ausrüstung in Kombination mit einem "positiv/negativ-Switching"-HRMS-System erstellt, der insbesondere für das Non-Target-Screening geeignet ist. Neben klassisch detektierbaren unpolaren sowie polaren Molekülen werden hiermit auch sehr polare (und deshalb gut wasserlösliche) Moleküle in einer umweltrelevanten Wasserprobe "sichtbar", auch z. B. persistente und sehr mobile Moleküle (sog. vPvM-Substanzen). Im Folgenden wird das System mit Schritten der Methodenentwicklung vorgestellt, die am Analytischen Forschungsinstitut für Non-Target Screening (kurz AFIN-TS) erarbeitet wurde. AFIN-TS ist ein unabhängiges Ausbildungs-, Beratungs-, Transfer-, Analyse- und Forschungsinstitut mit Fokus im Bereich der Chromatographie, Massenspektrometrie und des Non-Target-Screenings.

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Für eine ganzheitliche Betrachtung komplexer Proben ist es erforderlich, chromatographische Trenntechniken zu erweitern und direkt mit der empfindlichen und hochauflösenden spektrometrischen Detektion (HRMS) kompatibel zu machen. In einem früheren Überblick aus dem Jahr 2012 [1] wurde gezeigt, dass polaritätserweiterte chromatographische Trenntechniken (wie die serielle Kopplung von RPLC mit HILIC) gleichzeitig unpolare, polare und sehr polare Moleküle in einem Lauf trennen können. Inzwischen wird die serielle RPLC-HILIC in Kombination mit HRMS häufig in der Wasseranalytik [2] und in verschiedenen anderen Disziplinen angewendet [3]. Diese Trenntechnik wurde in weit mehr als 35 (peer-reviewed) Artikeln veröffentlicht (angewandt als wässrige Lösungen oder andere Lösungsmittelextrakte). Damit konnten bisher Moleküle in einem sehr weiten Polaritätsbereich (bis zu log(D)-Werten –7 bis +7) getrennt werden [3, 4].

Bild 1: Anordnung der instrumentellen Komponenten bei der hier verwendeten seriellen RPLC-HILIC in Kombination mit HRMS. © AFIN-TS

Aufgrund weiter entwickelter Trenngeräte und Materialien (z. B. Ultrahochdruck-Flüssigphasenpumpen, Sub-2-µm-Partikel usw.) wurde der ursprüngliche Instrumentenaufbau vollständig überarbeitet. Dabei sollten allerdings die Stabilität der Probeninjektion (insbesondere für die HILIC-Trennleistung), die Robustheit der Retentionszeiten (< 2 %) und andere Qualitätskriterien gleichbleiben wie mit dem ursprünglichen Aufbau [4]. Andererseits sollte der Zeitbedarf für die Trennung deutlich verkürzt werden, der früher verwendete Salzgradient in der mobilen Phase bei HILIC vermieden werden und der Ausgangsgehalt an Wasser bei 5 % liegen. Nicht zuletzt aufgrund neuer massenspektrometrischer Ionenquellenkonzepte wurde der bisher häufig eingesetzte "Make-up-Flow" überflüssig, und es konnte eine "positiv/negativ-Switching"-Ionisation in der HRMS eingesetzt werden. Die Anordnung der instrumentellen Komponenten (Bild 1) bleibt jedoch gleich wie in der ursprünglich beschriebenen Methode.

Instrumentelles

Bild 2: Systembedingungen der UHPLC-Kopplung. © AFIN-TS

Der chromatographische Aufbau bestand aus einem "Vanquish Flex LC"-System von Thermo Fisher Scientific mit zwei binären Pumpen, einem Autosampler und einem Säulenofen, der eine HILIC- und eine RPLC-Säule enthielt, die über ein T-Stück in Reihe geschaltet waren. Die RP-Trennung wurde auf einer "ThermoFisher Accucore"-C18-Säule, (50 x 2,1 mm, 2,6 µm, P/N 17126-052130) durchgeführt. Die mobile Phase der RPLC-Trennpumpe bestand aus A: H2O/ACN 95/5 (v/v) mit 5 mM NH4 Ac (Ammoniumacetat) und B: ACN/H2O 95/5 (v/v) mit 5 mM NH4Ac. Die HILIC-Trennung wurde auf einer "ThermoFisher Synchronis" HILIC-Säule (100 x 2,1 mm, 1,7 µm, P/N 97502-102130) durchgeführt. Die mobile Phase der HILIC-Trennpumpen bestand für Lösung A aus ACN (Acetonitril) und für Lösung B aus H2O/ACN 95/5 (v/v). Informationen zu den Gradienten sind in Bild 2 (linke Seite) zu finden. Das Injektionsvolumen betrug 10 µl. Das chromatographische System war an ein Orbitrap-Massenspektrometer "Exploris 120" (Thermo Fisher Scientific) angeschlossen, das mit einer Elektrospray-Ionisationsquelle (Modell H-ESI) ausgestattet war.

Durch die Verwendung kleinerer Partikel in den stationären Phasen in Kombination mit Ultrahochdruck-Flüssigphasenpumpen (UHPLC) konnte die Trennung von 58 Minuten auf ca. 35 Minuten beschleunigt werden. Dies ist auf die höheren Durchflussraten a) der HILIC-Säule (1,7 µm Partikelgröße; Durchflussrate von 600 µl/min) und b) der RPLC-Säule (2,6 µm Partikelgröße; maximalen Durchflussrate von 200 µl/min zurückzuführen (s. hierzu Bild 2). Das führt letztlich zu schnelleren Gradienten der mobilen Phase und auch zu einer beschleunigten Re-Äquilibrierung.

Bild 3: Retentionszeit-Masse-Plot für 296 organische Moleküle aus der Messung mit der weiter entwickelten seriellen Kopplung. © AFIN-TS

In Bild 3 sind die Referenzsubstanzen schematisch dargestellt, die mit dem Flussgradienten in der HILIC-Säule (s. links: blauer Kasten) und dem nachfolgenden Flussgradienten in der RPLC-Säule (s. rechts: roter Kasten) getrennt wurden. Details zu den verwendeten Materialien, Methoden und Chemikalien finden sich in der ausführlichen "Technical note" hierzu [5]. Im Folgenden werden einige Schlüsselaspekte bei der Entwicklung des neuen Aufbaus vorgestellt.

Vorgehensweise zur Methodenoptimierung

Zu Beginn der Methodenoptimierung wurden die RPLC- und HILIC-Trennungen getrennt bewertet, um die Beiträge der einzelnen Säulen zu den Gesamttrennungen zu beurteilen. Daher wurden nur einzelne Säulen getestet oder die mobile Phasenzusammensetzung der Säule, die nicht in einem Experiment untersucht wurde, wurde bei hoher Elutionsstärke gehalten (hoher Acetonitrilgehalt bei RPLC bzw. hoher Wassergehalt bei HILIC).

a) HILIC-Trennung: Die ursprüngliche Methode für die HILIC-Trennung bestand aus einer isokratischen Anfangsphase von sechs Minuten bei 100 % Acetonitril, gefolgt von einem Gradienten der mobilen Phase auf 60 % Acetonitril und 40 % Wasser innerhalb von sieben Minuten (5,7 %/min). In einem ersten Test wurde diese Methode mit dem neuen Aufbau und der neuen stationären Phase verwendet. Auf den Gradienten der mobilen Phase folgte ein isokratischer Fluss bei 40 % Wasser, um die Elution von stark retardierten Verbindungen zu bewerten. In einem nächsten Schritt wurde der Gradient schrittweise erhöht, um die Elution dieser Verbindungen zu fördern. Schließlich zeigte ein Gradient bis zu 70 % Wasser die beste Leistung. Die Steilheit des Gradienten wurde deshalb auf 8,8 %/min erhöht, was einen Gradienten von 0 auf 70 % Wasser in acht Minuten ergab. Die endgültige Flussrate der HILIC-Pumpe wurde auf 0,6 ml/min eingestellt.

b) RPLC-Trennung: Die ursprüngliche Methode bestand aus einem isokratischen Halten eines 100 %igen Lösungsmittels A für sieben Minuten, gefolgt von einem Gradienten auf 50 % Lösungsmittel B innerhalb von fünf Minuten, einer Erhöhung der Flussrate von 0,05 ml/min auf 0,1 ml/min innerhalb einer Minute und einem anschließenden Gradienten auf 100 % Lösungsmittel B innerhalb von neun Minuten. Die Durchführung wurde durch die Entkopplung der Gradienten der mobilen Phase und der Erhöhung der Flussrate vereinfacht. Bei der endgültigen Methode wurde der anfängliche isokratische Fluss über neun Minuten mit einer Flussrate von 0,035 ml/min gehalten, gefolgt von einer Erhöhung der Flussrate auf 0,2 ml/min innerhalb von 0,1 Minuten. Der folgende Gradient der mobilen Phase erhöhte den Gehalt an Lösungsmittel B innerhalb von 12 Minuten von 0 auf 100 % (8,3 %/min).

Optimierung der säulengekoppelten Methode

a) Salzkonzentration: Bei der ursprünglichen Methode gab es einen Salzgradienten (Ammoniumacetat), der die Dicke der Wasserschicht auf der HILIC-Säule über den Lauf hinweg beeinflusste. Dies war darauf zurückzuführen, dass die mobilen Phasen aus Mischungen von Acetonitril und 10 mM Ammoniumacetat in Wasser bestanden. Bei der hier verwendeten neueren Methode wurden die Lösungsmittel durch Mischungen aus Acetonitril und Wasser mit einem Gehalt von 5 mM Ammoniumacetat ersetzt. Infolgedessen sollte die notwendige Wasserschicht auf der HILIC-Trennsäule nicht durch wechselnde Salzgehalte während der Gradienten der mobilen Phase beeinflusst werden (was vermutlich die Robustheit der HILIC weiter erhöht). Während der Trennmechanismus bei der RPLC mit unpolaren endgekappten stationären Phasen nahezu unabhängig vom Salzgehalt ist, reagiert die HILIC sehr empfindlich auf Salzänderungen.

b) Rekonditionierungsbedingungen: Das Gleichgewicht hängt nicht von der Re-Äquilibrierungszeit ab, sondern vom Lösungsmittelvolumen, das durch die Säule fließt. Bei der RPLC werden etwa zehn Säulenvolumina benötigt, während bei der HILIC in der Regel bis zu 20 – 30 Säulenvolumina für eine vollständige Re-Äquilibrierung erforderlich sind. Bei einer Dimension von 100 x 2,1 mm für die HILIC-Säule betrug das Säulenvolumen etwa 250 µl. Mit den vordefinierten mobilen Flussraten von 0,035 ml/min von Pumpe 1 und 0,6 ml/min von Pumpe 2 sollte die Re-Äquilibrierung innerhalb von acht bis zwölf Minuten ausreichend sein. Der Re-Äquilibrierungszustand wurde mit mehreren Injektionen nach definierten Re-Äquilibrierungszeiten getestet. Schließlich zeigte eine Re-Äquilibrierungsphase von elf Minuten geeignete Ergebnisse bei der Reproduzierbarkeit der Retentionszeiten (Bild 4).

Bild 4: Retentionszeit (RT)-Plots von Injektionen mit verschiedenen Re-Äquilibrierungszeiten. © AFIN-TS

c) Gesamtlaufzeit: Die ursprüngliche Methode dauerte fast 60 Minuten. Da die Flüssigkeitschromatographie unter Ultrahochdruckbedingungen sehr stabil ist (z. B. bei der Verwendung von UHPLC-Pumpen und Sub-2-µm-Teilchen sowie Core-Shell-Partikeln) und da Massenspektrometer auch mit höheren Detektionsraten arbeiten, konnte die Laufzeit deutlich reduziert werden. Dies war auf zwei unabhängige Faktoren zurückzuführen: auf die Trenngeschwindigkeit und auf die angepasste Re-Äquilibrierungsphase. Infolgedessen konnte die endgültige Methode auf eine Gesamtlaufzeit von 35 Minuten verkürzt werden. Dies ist eine erhebliche Verbesserung gegenüber der ursprünglichen Methode, so dass diese Methode in der Routineanalyse mit höherem Durchsatz eingesetzt werden kann.

Fazit

Mit dem hier vorgestellten RPLC-HILIC-Setup können komplexe Proben innerhalb von 35 Minuten auf sehr polare bis unpolare Verbindungen gescreent werden. In Verbindung mit dem hier eingesetzten Massenspektrometer zur Detektion können Proben im Hochdurchsatz gescreent werden. Da hiermit im positiven und negativen Ionisierungsmodus parallel analysiert werden kann, kann die Analysezeit weiter signifikant reduziert werden. Von ursprünglich acht Stunden (ein Spüllauf, drei Wiederholungsanalysen der Probe im positiven Ionisierungsmodus, ein Spüllauf, drei Wiederholungsanalysen der Probe im negativen Ionisierungsmodus, jeweils 60 Minuten lang) konnte die Zeit für die Analyse einer Probe auf etwa 2,5 Stunden reduziert werden (ein Spüllauf, drei Wiederholungsanalysen der Probe im parallelen positiven und negativen Ionisierungsmodus, jeweils 35 Minuten). Das ist weniger als 1/3 der ursprünglichen Analysedauer.

Ein Jahrzehnt nach der Einführung der RPLC-HILIC-MS(/MS)-Methode für analytische Zielsetzungen – auch für das Non-Target-Screening – findet die Technik von reinen Entdeckungsanwendungen breitere Anwendung in Forschungs- oder auch Auftragslaboren. Der hier verwendete "polaritätserweiterte" chromatographische Trennaufbau mit der seriellen RPLC-HILIC-Kopplung (durch einfache Kombination mit Gradientenpumpen über T-Stücke) kann für zahlreiche Anwendungen von Nutzen sein. Der Einsatz der seriellen Kopplung erweitert den analytisch zugänglichen Raum und kann ganz neue Einblicke ermöglichen. Bild 5 zeigt beispielhaft Daten einer mittels RPLC-HILIC ESI-MS/MS analysierten Wasserprobe einer Partnereinrichtung (ESI = electrospray ionization). Darin lassen sich mehr als 900 Massensignale nachweisen. Diese verteilen sich hier in ähnlichen Anteilen auf die HILIC- und die RPLC-Trennung (512 zu 404 Signale). Die "polaritätserweiterte" Chromatographie kann in der Umweltanalytik, aber auch der Lebensmittelanalytik, in Metabolomics, dem chemischen und pharmakologischen Prozessmonitoring sowie Non-Target-Analytik in anderen Bereichen eingesetzt werden.

Bild 5: Retentionszeit-Massen-Plot einer Wasserprobe, die mittels RPLC-HILIC-MS/MS analysiert wurde. Insgesamt konnten darin 916 Massensignale detektiert werden. 512 davon stammen aus der HILIC-Trennung, 404 aus der RPLC. © AFIN-TS

Danksagung

Wir danken Thermo Fisher Scientific für die erfolgreiche Zusammenarbeit und allen Kollegen, die an der Projektentwicklung beteiligt waren. Das FuE-Kooperationsprojekt (mit dem Förderkennzeichen KK5035801SA) wird von der AiF Projekt GmbH im Rahmen des Programms "Zentrales Innovationsprogramm Mittelstand" (ZIM) durch das Bundesministerium für Wirtschaft und Energie aufgrund eines Beschlusses des Deutschen Bundestages gefördert.

Literatur:
[1] G. Greco, T. Letzel (2012) The hyphenation of HILIC, RP- HPLC and API – MS. LCGC N. America and Spectroscopy supplement: Current Trends in Mass Spectrometry, 10 (2), 40–44. Open access.
[2] S. Bieber, T. Letzel (2020) White Paper – Polarity-Extended Chromatography: A holistic solution analyzing organic molecules in the oqueous environment? AFIN-TS Forum, February (1), 1–4. Open access.
[3] S. Bieber, T. Letzel (2022) White Paper – Serial RPLC-HILIC coupling hyphenated with mass spectrometric detection: Polarity-extended chromatography fit for NTS? AFIN-TS Forum, April (7): 1–15. Open access.
[4] S. Bieber, G. Greco, S. Grosse, T. Letzel (2017) RPLC-HILIC and SFC with Mass Spectrometry: Polarity-Extended Organic Molecule Screening in Environmental (Water) Samples. Analytical Chemistry 89:7907–7914.
[5] Bieber S. and Letzel T. (2022) Technical Note – Serial RPLC-HILIC coupling hyphenated with Orbitrap mass spectrometric detection: Next generation in Non-Target Screening, AFIN-TS Forum; November (8): 1–10.

AUTOREN
Dr. Stefan Bieber, Dr. Thomas Letzel
Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH, Augsburg
[email protected]
www.afin-ts.de

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