Analytische Chromatographie
SFC-HRMS – eine grüne, polaritätserweiternde Methode für die Spurenstoffanalytik
Die Chromatographie mit Kohlenstoffdioxid (CO2) als mobile Phase, kurz SFC (von: Supercritical fluid chromatography) ist in letzten Jahrzehnten weiterentwickelt worden. Zwei Autoren zeigen Entwicklungen und Möglichkeiten der SFC gekoppelt mit Massenspektrometrie und geben einen Vergleich mit anderen Methoden mit Blick auf polare Analyten.
Die Chromatographie mit Kohlenstoffdioxid (CO2) als mobile Phase, kurz SFC (von: Supercritical fluid chromatography) ist bereits seit den 60er Jahren des vergangenen Jahrhunderts bekannt [1]. Die Technik entwickelte sich fast parallel zur Flüssigchromatographie (LC), konnte aber nie deren Bekanntheitsgrad und Beliebtheit erreichen. Über die letzten Jahrzehnte hinweg wurde aber weiterhin intensiv an der Entwicklung robuster Geräte zur Nutzung der SFC gearbeitet, insbesondere in Kopplung mit hochauflösender Massenspektrometrie (HRMS) zur Detektion der Moleküle.
Der Wendepunkt für die SFC als zuverlässige Trenntechnik fand zunächst im Bereich der chiralen Chromatographie statt. Ende der 1980er Jahre konnte gezeigt werden, dass sich die Trennung von Enantiomeren mittels SFC deutlich schneller und effizienter als mit der LC umsetzen lässt. Zudem wird wesentlich weniger organisches Lösungsmittel benötigt. Damit gelang der SFC der Durchbruch im Pharmabereich auch als "grüne" Aufreinigungstechnik für Wirkstoffe, insbesondere im (semi)präparativen Maßstab.
Seit dem Jahr 2010 haben mehrere Gerätehersteller neu entwickelte Geräte für die analytische SFC auf den Markt gebracht. Damit stieg der Bekanntheitsgrad dieser Trenntechnik, was sich schließlich auch positiv auf die Breite ihrer Einsatzbereiche auswirkte. Neben der chiralen Trennung ist die SFC nämlich besonders für die Trennung von nicht-chiralen Analyten geeignet. So etablierten sich in vielen Anwendungen die alternativen Trennmethoden mittels SFC schnell, denn diese zeigen teils große Vorteile gegenüber ähnlichen Anwendungen mittels LC und Gaschromatographie (GC). Hier ist oftmals die Selektivität breiter, die Effizienz besser und die Analysegeschwindigkeit höher. Dies liegt unter anderem an der Verwendbarkeit von stationären Phasen aus der LC und der CO2-haltigen mobilen Phase. Bild 1 (Ergebnisse einer Studie aus dem Jahr 2023, [2]) zeigt Diffusionsfähigkeit und Lösungsvermögen der mobilen Phase bei der SFC gegenüber LC und GC; die massenspektrometrische Sensitivität lag dabei im Bereich zwischen LC und GC.
Eine Besonderheit in der SFC ist auch die Möglichkeit, kombinierte stationäre Phasen mit unterschiedlichen Retentionsmodi verwenden zu können. Die Selektivität der gesamten (kombinierten) stationären Phase ist hier keine Kombination, sondern eine sequenzielle Ergänzung der Selektivitäten der einzelnen Phasen. Dieser "additive" Effekt kann durch das Verbinden verschiedener Säulen oder durch kleine Partitionen mit unterschiedlicher Selektivität in einer Säule erreicht werden [3, 4]. Als stationäre Phase können prinzipiell alle Säulenmaterialien eingesetzt werden, die man auch aus der LC kennt. Da die SFC von der Zusammensetzung der mobilen Phase her eher normalphasenvergleichbar ist (Gradientenverlauf von unpolar zu polar), sind Säulenmaterialien der Normalphasen-Flüssigchromatographie und der HILIC (hydrophile Interaktions-Flüssigchromatographie) in der Regel besser und breiter für SFC-Applikationen einsetzbar als die der Umkehrphasen-Flüssigchromatographie und ermöglichen eine sehr gute Retention und Trennung von polaren und sehr polaren Molekülen.
SFC-Trennungen für nicht-chirale Analyten basieren meist auf einer mobilen Phase aus Kohlenstoffdioxid und organischem Lösungsmittel (häufig Methanol oder Isopropanol), die – wie auch in der LC – als Gradienten zum Einsatz kommen können. Auf Grund des sehr unpolaren Charakters von Kohlenstoffdioxid ist in dieser Kombination das organische Lösungsmittel das polare Lösungsmittel. Weitere Zugaben wie Puffer und Salze zur Unterstützung der Analytenelution sind möglich, sofern diese in dem organischen Lösungsmittel löslich sind.
Die Zusammensetzung der mobilen Phase aus Kohlenstoffdioxid und organischem Lösungsmittel macht die SFC letztlich auch sehr gut kombinierbar mit der massenspektrometrischen Detektion. Dabei kommt meistens die Elektrospray-Ionisation (ESI) als sanfte Ionenquelle zum Einsatz. Moleküle aus SFC-Trennungen werden dort nach Entspannung des Kohlenstoffdioxids im Spray der Ionenquelle effizient in die Gasphase transferiert und können dann als Ionen empfindlich in der Massenspektrometrie (MS) detektiert werden.
Auf Grund dieser Eigenschaften konnte die SFC in den vergangenen Jahren sehr erfolgreich in vielen analytischen Bereichen etabliert werden. Meist handelt es sich dabei um Applikationen zur Trennung von einzelnen, speziellen und teils strukturell sehr ähnlichen Analyten [4], aber auch für die Trennung von ganzen Substanzklassen, wie fettlöslichen Vitaminen [5] oder anthropogenen wasserkontaminierenden Umweltchemikalien [6]. Ein deutlich breiteres Analytspektrum kann man dabei mit sog. Screening-Ansätzen erschließen. Neben Target- und Suspect-Screening, bei denen man sich auf bekannte bzw. erwartete Verbindungen in Proben fokussiert, versucht man beim Non-Target-Screening möglichst alle analytisch zugänglichen Verbindungen in Proben zu detektieren und zu charakterisieren. Dies ist in vielen Bereichen, in denen man mit komplexen Proben und einer unbekannten Probenzusammensetzung zu tun hat, von Interesse. Besonders dort wird seit längerem nach Trenntechniken gesucht, die das bisher erreichbare Analytspektrum signifikant erweitern könnten.
Da bei den Screening-Technologien oft LC zum Einsatz kommt, werden Techniken benötigt, die in den Bereich der polaren bis sehr polaren organischen (d. h. der stark wasserlöslichen) Analyten vordringen können. Bild 2 zeigt eine Übersicht der derzeit möglichen Chromatographietechniken (alle derzeit MS-koppelbaren und einen großen Bereich des sog. "Chemical Space" abdeckend). Sowohl Kapillarelektrophorese, Ionenchromatographie als auch Mixed-Mode-Chromatographie können hierfür eingesetzt werden, allerdings erfassen diese Techniken teils nur geladene Analyten und müssen als zweite Technik neben der Umkehrphasen-Flüssigchromatographie etabliert werden. Als Alternative dazu stehen HILIC, aber auch 2D-LC-Systeme sowie polaritätserweiterte Trenntechniken, wie die serielle Kopplung von HILIC und Umkehrphase [6, 7, 8] zur Verfügung und eben auch die SFC [2–6].
Mit verstärkt neu aufkommenden Substanzklassen, wie der PMT-Verbindungen (PMT steht für: persistent, mobil und toxisch), welche auch Barrieren der Trinkwasseraufbereitung überwinden können und die häufig sehr polar sind, wird die Etablierung einer umfassenden analytischen Technik besonders wichtig. Mit der SFC könnten diese Verbindungen zusätzlich zu den bereits bekannten und überwachten Verbindungen in einer analytischen Methode in Wasserproben gemonitort werden. Durch die große Breite an trennbaren Analyten und die sehr gute Koppelbarkeit der Trenntechnik mit (hochauflösender) Massenspektrometrie hat die SFC im Bereich Non-Target eine Alleinstellung. In Bild 3 ist beispielshaft eine Analyse von sehr unpolaren bis zu sehr polaren Substanzen als Retentionszeit-Masse-Plot dargestellt. Jüngste Entwicklungen und Studien zu speziellen Säulenkombinationen [3, 4], einem Ionisierungseffizienz-Vorhersagemodell [9] und nachweisstarkem HRMS-Screening [2] zeigen, dass die SFC ein nachhaltiges und robustes Werkzeug auch für die Analyse von "schwierigen" Analyten in einer großen Polaritätsbreite darstellt.
Literatur
[1] E. Klesper, A. H. Corwin, D. A. Turner (1962) High pressure gas chromatography above critical temperatures. J Org Chem 27:700–701.
[2] S. Bieber and T. Letzel (2023) Technical Note – Superkritische Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit einem Orbitrap Exploris 120 Massenspektrometer – Quantitativer Blickpunkt, AFIN-TS Forum; August (9); deutsch: 1–14.
[3] S. Bieber and T. Letzel (2021) Achiral SFC Separations – Gold Standard for the Next Generation of Non-Target Screening. Analytical Science Advances, 2: 43–46.
[4] Bieber, P. Schmitt-Kopplin, M. Witting, and T. Letzel (2020) Research Paper – Separation of steroid hormones by supercritical fluid chromatography using combined stationary phase selectivity. AFIN-TS Forum, April (3): 1–8.
[5] L. Toribio, J. Bernal, M.T. Martín, A.M. Ares (2021) Supercritical fluid chromatography coupled to mass spectrometry: A valuable tool in food analysis. Trends in Analytical
Chemistry 143 116350.
[6] S. Bieber, G. Greco, S. Grosse, and T. Letzel (2017) RPLC-HILIC and SFC with mass spectrometry: Polarity-extended organic molecule screening in environmental (water) samples. Analytical Chemistry, 89, 7907–7914.
[7] S. Bieber und T. Letzel (2023) Serielle RPLC-HILIC-Kopplung mit hochauflösender MS. LABO 12/2023, 12–16.
[8] S. Bieber and T. Letzel (2022) White Paper – Serial RPLC-HILIC coupling hyphenated with mass spectrometric detection – Polarity-extended chromatography fit for NTS? AFIN-TS Forum; April (7): 1–15.
[9] S. Bieber, T. Letzel, and A. Kruve (2023) Electrospray Ionization Efficiency Predictions and analytical standard free quantification for SFC/ESI/HRMS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry 34(7), 1511–1518.
AUTOREN
Dr. Stefan Bieber, Dr. Thomas Letzel
Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH, Augsburg
[email protected]
www.afin-ts.de
Analytica: Halle 3, Stand 302
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