Je nachdem, wie die beiden Aminosäuren verknüpft sind, wird zwischen Gamma-, Alpha- und X-Glutamyl-Dipeptiden unterschieden, wobei die beiden letzteren nicht zum Kokumi-Effekt beitragen. Die hohe Polarität der Glutamyl-Dipeptide sowie ihre große strukturelle Ähnlichkeit bei unterschiedlichem Geschmacksbeitrag stellen eine große Herausforderung für die Lebensmittelanalytik dar.

Effiziente Analyse-Methode

Dem Team um Studienleiter Andreas Dunkel vom Leibniz-Institut ist es gelungen, eine effiziente Analyse-Methode zu entwickeln, die auf Ultrahochleistungs-Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie basiert. Mit ihr lassen sich die Konzentrationen aller 56 Gamma-Glutamyl-Dipeptid-Varianten präzise und selektiv in rund 22 Minuten bestimmen. Mit Hilfe einer verbesserten Probenvorbereitung war dabei die Analyse von 60 Käseproben pro Tag möglich.

"Das ist eine deutliche Verbesserung im Vergleich zu anderen Methoden. Unsere Tests haben gezeigt, dass unsere Methode schneller, effizienter und trotzdem zuverlässig ist – sie liefert reproduzierbare Ergebnisse und erfasst bereits kleinste Konzentrationen", sagt die Erstautorin der entsprechenden Publikation Sonja Maria Fröhlich, Doktorandin am Leibniz-Institut. Um den Einfluss der Reifezeit auf die Gamma-Glutamyl-Dipeptid-Konzentrationen genauer zu untersuchen, wandten die Forschenden die Methode nach der Testphase auf 122 Käseproben aus Europa und aus den USA an. Die Reifezeiten der Käse lagen dabei zwischen zwei Wochen und 15 Jahren.

Probenaufbereitung

Das Forschungsteam um Dr. Andreas Dunkel nutzt einen sog. Bead-Beater-Homogenisator, um mehrere Proben gleichzeitig zu homogenisieren. In das Gerät können mehrere Probengefäße eingesetzt und daher in einem Arbeitsgang parallel bearbeitet werden. Zudem werden hier im Vergleich zu früheren beschriebenen Verfahren geringere Probenmengen benötigt, und eine Gefriertrocknung entfällt. Um die Methode zur Extraktion der Gamma-Glutamylpeptide zu optimieren, wurden die Extraktionslösungsmittel variiert sowie die Anzahl der erforderlichen Extraktionswiederholungen in zahlreichen Tests herausgefunden. Die "beste" Extraktionsmethode wurde validiert. Dazu wurden ein sechs Wochen alter Gouda-Käse, der die Gruppe der Käse mit kurzer Reifezeit repräsentiert, und ein zwei Jahre alter Parmesan als Beispiel für Käseproben mit fortgeschrittenem Proteinabbau verwendet. Die Analyse der Extraktionsschritte ergab, dass eine Extraktionsausbeute von mindestens 95% nach drei Wiederholungen erreicht wird.

Wasser zeigte die beste Extraktionsleistung im ersten Extraktionsschritt, insbesondere für die Gamma-Glutamyl-Dipeptide. Das Gemisch aus Wasser und Acetonitril (30/70, v/v) zeigte jedoch für die beiden anderen Analytgruppen, insbesondere für Käse mit längerer Reifzeit, bessere Extraktionsergebnisse. Für Met-Glu (Methionylglutaminsäure) zum Beispiel liefert ACN/Wasser (70/30, v/v) eine deutlich bessere Extraktion als ein höherer Wassergehalt oder nur Wasser. Aus diesem Grund wurde für das Aufarbeitungsprotokoll schließlich eine Kombination aus beiden Extraktionsmitteln verwendet. Im ersten Schritt wurde nur Wasser verwendet, während im zweiten und dritten Schritt eine Mischung aus Wasser und Acetonitril eingesetzt wurde. Ein weiterer Vorteil von höheren Acetonitril-Konzentrationen ist, dass eine Denaturierung der Enzyme in der Probenmatrix bewirkt wird, was Folgereaktionen während der Aufarbeitung und Lagerung verhindert.

Vorgehensweise

Precellys Evolution Homogenizer (rechts) mit Cyrolys-Kühlmodul (links) von Bertin Technologies. Die Homogenisierung in diesem sog. Bead Beater erfolgt mit Hilfe von Keramikperlen. © Leibniz-LSB@TUM

Für die Analyse wird 1 g einer Käseprobe zusammen mit 3,90 ml deionisiertem Wasser und 100 μl einer internen Standardmischung in ein 15-ml-Bead-Beater-Röhrchen von Bertin Technologies mit Keramikkugeln (2,8 mm Durchmesser) gegeben. Die Probe wurde mit einem Perlschlagwerk (Precellys Evolution Homogenizer von Bertin Technologies) dreimal für eine Dauer von 25 Sekunden mit 15 s Unterbrechung bei 6400 rpm homogenisiert und dann anschließend in einem Thermoshaker (HLC BioTech) 30 Minuten bei Raumtemperatur equilibriert. Anschließend wurde die Probe 30 Minuten lang bei 4 °C mit einer Beschleunigung von 4 260 g zentrifugiert (verwendete Zentrifuge: Multifuge 3 L-R von Heraeus). Die Fettphase wurde mit einem Spatel entfernt und verworfen. Der wässrige Überstand wurde separiert und gesammelt. Das verbleibende Proteinpellet wurde zwei weitere Male mit 3 ml eines Acetonitril/Wasser-Gemisches (70/30, v/v) extrahiert und zentrifugiert. Die wässrigen Rückstände aus den drei Extraktionsschritten wurden vereinigt und mittels eines Spritzenfilters (0,45 μm, regenerierte Cellulose, Sartorius) filtriert und bis zur Analyse bei –20 °C gelagert.

Schimmelkulturen beschleunigen Geschmacksentwicklung

Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentrationen von Glutamyl-Dipeptiden erwartungsgemäß mit zunehmendem Reifegrad ansteigen. "Interessanterweise führte die Zugabe von Blau- und Weißschimmelkulturen zu deutlich höheren Gamma-Glutamyl-Dipeptid-Konzentrationen, selbst bei kürzeren Reifezeiten", sagt Dr. Andreas Dunkel, der am Leibniz-Institut die Arbeitsgruppe Integrative Food Systems Analysis leitet.

Der promovierte Lebensmittelchemiker ergänzt: "Die von uns ermittelten Konzentrationsprofile für verschiedene Reifestadien und Käsesorten lassen sich zukünftig als Datenbasis für Vorhersagemodelle verwenden. Letztere könnten beispielsweise dazu dienen, die Geschmacksentwicklung während der Käsereifung objektiv zu überwachen, Reifezeiten zu verkürzen oder neue pflanzliche Käseprodukte mit hoher Verbraucherakzeptanz zu entwickeln."

"Im Sinne eines interdisziplinären, lebensmittelsystembiologischen Forschungsansatzes ist eins unserer Ziele, analytische Forschungsergebnisse mit bioinformatischen Methoden zu verknüpfen, um Vorhersagemodelle zu entwickeln, die geeignet sind, eine nachhaltige Lebensmittelproduktion zu unterstützen. Hier setzt auch das von Andreas Dunkel geleitete Projekt an", schließt Prof. Dr. Veronika Somoza, Direktorin des Freisinger Leibniz-Instituts.

Förderung

Dieses IGF-Vorhaben der Forschungsvereinigung Forschungskreis der Ernährungsindustrie e. V. (FEI) wurde im Rahmen des Programms zur Förderung der Industriellen Gemeinschaftsforschung (IGF) vom Bundesministerium für Wirtschaft und Klimaschutz (BMWK) gefördert.

Publikation:
Sonja Maria Fröhlich, Manon Jünger, Verena Karolin Mittermeier-Kleßinger, Corinna Dawid, Thomas F. Hofmann, Veronika Somoza, Andreas Dunkel: Towards prediction of maturation-dependent kokumi taste in cheese by comprehensive high throughput quantitation of glutamyl dipeptides, Food Chemistry, Volume 463, Part 1, 2025, 141130, DOI/10.1016/j.foodchem.2024.141130.

Quelle: Leibniz-Institut für Lebensmittel-Systembiologie an der TU München