Effektives Hochdurchsatz-RNAi-Screening

1. Ltd., 8 River Street, Westbourne, West Sussex, PO10 8TG, United Kingdom
   

Die RNA-Interferenz (RNAi) wurde innerhalb kurzer Zeit in der pharmazeutischen und Biotechnologie-Industrie zur Methode der Wahl für die Zielbestimmung und Evaluierung. Bei der Nutzbarmachung endogener zellulärer Pfade zur vorübergehenden Unterdrückung der Genfunktion bietet die experimentelle Verwendung von RNAi eine direkte Verbindung zwischen Gensequenz und Genfunktion in Form von „Funktionsverlust“-Phänotypen.

RNAi hat die biologische Forschung in den letzten Jahren wahrscheinlich am maßgeblichsten durch seine Verwendung im genomweiten Maßstab für kultivierte Zellen revolutioniert. Die gebräuchlichsten Methoden für Zellsysteme sind lange dsRNA mit ca. 500 Basenpaaren (BP) mit einer Länge für Zellen der Fruchtfliege Drosophila melanogaster und entweder kurze Haarnadel-RNAs (shRNAs) oder synthetische 21 BP siRNAs für Säugetierzellen[1]. Die Methoden für die Einbringung von siRNAs in Zellen sind unterschiedlich, aber ein effektives, in vielen Laboren verwendetes Verfahren ist die Transfektion durch Lipofektion. Eine siRNA und ein kationisches Lipidtransfektionsreagenz werden zu einem Komplex geformt und den Zellen hinzugefügt, um die Aufnahme in das Zytoplasma zu fördern. In der vorliegenden Studie haben wir versucht, diesen Prozess in Bezug auf die benötigte Zeit und die Kosteneffektivität bei Anwendungen mit hohem Durchsatz zu optimieren.

Ziele

Die Fähigkeit, Einmalspitzen wirksam zu waschen und gleichzeitig ihre Dispensiergenauigkeit aufrechtzuerhalten, stellt einen entscheidenden Fortschritt für Anwendungen mit hohem Durchsatz dar, um die Betriebskosten bei gleich bleibendem Durchsatz niedrig zu halten. Demzufolge sind, um eine kosteneffektive Auslese unter Verwendung von RNAi zu erzielen, wiederverwendbare Spitzen kombiniert mit angemessenen Waschprotokollen erforderlich, um eine Verschwendung von Zeit und Geld zu minimieren. Die Effektivität der Spitzenwäsche wurde in verschiedenen Studien [2,3,4] untersucht. Das vorliegende Experiment zeigt ein Protokoll zur wirksamen Entfernung des Transfektionskomplexes von den Einmalspitzen, so dass diese wieder verwendet und somit Kosten für Verbrauchsmaterialien reduziert werden können. Zudem lässt sich so die im Prozessablauf für den Spitzenaustausch benötigte Zeit einsparen. Der Anwender muss die Vor- und Nachteile zwischen dem Waschen oder Austauschen der Spitzen abwägen. Dabei muss in Betracht gezogen werden, dass durch das Waschen der Spitzen zwar die Kosten gesenkt werden, sich aber gleichzeitig auch die Verfahrensdauer verlängern, die Waschpufferverwendung erhöhen und eine Pufferansammlung in den Spitzen entstehen kann. Wichtig bei der Entscheidung, ob die Spitzen gewaschen werden sollen oder nicht, ist die Frage, ob diese Handlung eine Ansammlung von Waschpuffern zur Folge hat, was zu nachteiligen experimentellen Auswirkungen führt. Ein wesentlicher Vorteil der Spitzenwäsche besteht in der Zeiteinsparung (kein Spitzenaustausch erforderlich). Die Anzahl der für die Wäsche benötigten Zyklen hat auch einen Einfluss auf die erforderliche Waschflüssigkeit und auf die benötigte Zeit.

Geräte und Reagenzien

• CyBi^®-Well Vario, ausgestattet mit 96/25-µl-Kopf.
• Aktive Spitzenwaschstation für CyBi^®-Well vario 96
• CyBi^®-Tips 25 µl.
• Eppendorf automatische 8-Kanal-Handpipette (verschiedene Volumina).
• Thermo Multidrop 384.
• Applied Biosystems Prism 7900HT.
• Molecular Devices Discovery 1 (automatisches Mikroskop).
• Metamorph V.6.2 Software.
• Power Washer 384 von Tecan.
• Greiner 384-Well-µClear-Mikroplatten.
• Nunc 384-Well-Polystyrolmikroplatte.
• HeLa-Zellen.
• Oligofektamine (Invitrogen).
• Opti-MEM.
• 1x phosphatgepufferte Lösung (PBS).
• Paraformaldehyd 16 % (PFA).
• Eg5 (Kif11) siRNA (50 µM Stock).
• GAPDH siRNA (50 µM Stock).
• Höchst (33342) Kernfarbstoff.
• Rat Anti Alpha Tubulin (MCA77G).
• Invitek’s Invisorb RNA-Extraktionskit II.
• Applied Biosystems cDNA Reverse Transkriptionskit.
• Quantec Syber Green SensiMix (qRT-PCR Reagenzien).
• DNAse-, RNAse-freies, deionisiertes Wasser.
  

Verfahren

Zwei unabhängige Messungen für den RNAi-Effekt wurden in dieser Studie verwendet:

Visuelle Überwachung: Eg5 (KIF11) kodiert ein Motorprotein, das der Kinesin-ähnlichen Proteinfamilie angehört und das an der Chromosombewegung und der bipolaren Spindelbildung während der Zellmitose beteiligt ist. Eine Reduzierung der Eg5-mRNA-Expressionswerte verursacht mitotischen Arrest [5]. Der gesamte phänotypische Effekt nach 48 Stunden ist eine dramatische Reduzierung der Proliferation, einhergehend mit morphologischen Veränderungen der arretierten Zellkerne. Eg5 ist deshalb ein idealer visueller Indikator für die Überwachung des RNAi-Effekts.
qRT-PCR: siRNA, welche GAPDH als Target hat, reduziert bekanntermaßen die Expression von GAPDH um 70...95 % bei vielen Zelllinien einschließlich HeLa3 ohne sichtbare phänotypische Veränderungen [6]. Der Funktionsverlust des Gens wird durch quantitative Real Time PCR (qRT-PCR) eingeschätzt. Neg1 ist eine gescrambelte Kontroll-siRNA ohne Gegenstück im menschlichen Transkriptom, die entwickelt wurde, um den Effekt des Transfektionsprozesses auf die Zellen zu überwachen.

Um zu beurteilen, ob Waschzyklen die Reste des siRNA-Komplexes effektiv entfernen und dementsprechend die Spitze wiederverwendbar machen, wurde der folgende Assayaufbau verwendet. HeLa-Zellen (80 Zellen/µl) wurden auf zwei Greiner µClear 384 Wellplatten in 25 µl Opti-MEM mit einem Thermo Multidrop 384 ausgesät und 24 Stunden lang bei einer Temperatur von 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert; damit wird 70...80 % Konfluenz zum Zeitpunkt der Transfektion erreicht. Zur Transfektion wurden zwei 384-Well-Platten mit transparentem Boden (Nunc) verwendet, um die Komplexmischung für die Transfektion vorzubereiten, welche eine Endkonzentration von 30 nM siRNA mit Oligofectamin und Opti-MEM als Verdünnungslösung gemäß den Anweisungen des Herstellers enthält.

Diese Ausgangsplatten wurden dann verwendet, um 5 µl des siRNA-Komplexes auf die Greiner-Assayplatten, welche die HeLa-Zellen enthielten, zu übertragen. Das wurde unter Verwendung von CyBi^®-Well vario, ausgestattet mit einem 96/25µl-Kopf, erreicht. Quadrant 1 von der siRNA-Ausgangsplatte wurde auf Quadrant 1 der Assayplatte mit 3 µl/s Aspirieren und Dispensieren übertragen. Sowohl der GAPDH- als auch der Eg5-siRNA-Komplex wurden in 48 Replikas auf die zwei 384-Well-Ausgangsplatten in Quadrant 1 mit nur Opti-MEM in den Quadranten 2, 3 und 4, wie abbgebildet, verteilt. Der Neg1-siRNA-Komplex wurde im Quadrant 1 auf die verbleibenden Wells positioniert.

Die Spitzen durchliefen danach drei Zyklen einer 25-µl-Wäsche bei 12 µl/s in RNase-freiem ddH₂O unter Verwendung der oben abgebildeten CyBio 96-Well-Waschstation. Darauffolgend wurden dieselben Spitzen zur Übertragung des Quadranten 2 der Ausgangsplatte verwendet – welcher Opti-MEM nur im Quadranten 2 der Zellplatten enthält, gefolgt von einem weiteren Waschzyklus mit denselben, zuvor genannten Parametern. Dieser Prozess wurde für die anderen beiden Quadranten, welche nur Opti-MEM enthalten, wiederholt. Die Zellplatten wurden dann für weitere 48 Stunden bei einer Temperatur von 37 °C mit 5 % CO₂ inkubiert.

Die GAPDH-transfektierte Zellplatte, die von der Ausgangsplatte 1 abgeleitet wurde, wurde dann lysiert und die RNA unter Verwendung des Invisorb-Extraktionskits II von Invitek extrahiert. Der Funktionsverlust für GAPDH wurde mittels qRT-PCR unter Verwendung von 18s-RNA-Amplifikation zur Normalisierung bestimmt. Die restlichen Werte von mRNA wurden als Prozentsatz von Neg1 als Kontrollwert ausgedrückt.

Die Eg5-transfektierten Zellen, die von der Ausgangsplatte 2 abgeleitet wurden, wurden durch das Hinzufügen von 10 µl von 16 % PFA und einer Inkubation bei Raumtemperatur von 30 Minuten fixiert. Die Platte wurde danach unter Verwendung des Tecan Power Washer 384 mit 3 x 200 µl PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit Höchst 30 Minuten lang eingefärbt, gefolgt von den oben genannten Waschschritten. Diese Platte wurde dann unter Verwendung eines automatischen Mikroskops Discovery 1 mit 10facher Vergrößerung an neun Positionen innerhalb eines Wells bei Einsatz eines DAPI-Filters aufgenommen. Die Aufnahmen wurden mit der Software MetaMorph analysiert, um die Anzahl der Kerne in jedem Well der 384-Wellplatte zu zählen.

Ergebnisse & Schlussfolgerungen

Die Wirkung der siRNA-Transfektion lag in beiden Experimenten innerhalb des erwarteten Bereiches, mit einer Reduzierung der Proliferation bei den Eg5-behandelten Zellen von mehr als 80 % und einer Reduzierung von mRNA bei den GAPDH-behandelten Zellen von mehr als 95 %. In beiden Fällen hatte die Transfektion selbst keine signifikante Wirkung auf die Zellen, wodurch der RNAi-Assayaufbau validiert wurde. Entscheidend war, dass Zellen, die Agens von Spitzen erhielten, welche einen Waschgang durchlaufen hatten, keinen RNAi-Effekt in den beiden Assays aufwiesen, was darauf hinweist, dass die Transfektionskomplexe durch den Waschvorgang ausreichend entfernt wurden. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass wir einen Waschvorgang mit RNAse-freiem ddH₂O etabliert haben, welcher Einmalspitzen für hohen Durchsatz wiederverwendbar macht.

Referenzen

1. Reynolds A, Anderson E, Vermeulen A, Fedorov Y, Robinson K, Leake D, Karpilow J, Marshall W, Khvorova A (2006). “Induction of the interferon response by siRNA is cell type- and duplex length-dependent“. RNA 12 (6): 988-93.
2. Development and evaluation of a micropipette tip washing system. M Khadra M, J I Richards JI, M M Robinson MM – Aug. 2000 (Bd. 242, Ausgabe 1-2, Seiten 1-8) J Immunol Methods 2000; 242:1-8.
3. Combinatorial dispensing as a fast and efficient means to create complex screens. Bart Hazes B - Dez. 2006 (Bd. 9, Ausgabe 10, Seiten 785-90) Comb Chem High Throughput Screen 2006; 9:785-90.
4. Improving IC50 Results with Acoustic Droplet Ejection. Joseph Olechno, Jean Shieh, Richard Ellson, Journal of the Association for Laboratory Automation, August 2006 (Bd. 11, Ausgabe 4, Seiten 240-246).
5. Ambion Cat #4639 Silencer® KIF11 (Eg5) siRNA (Mensch, Maus, Ratte) Eg5.
6. Ambion Cat #4633/4634 Silencer® GAPDH siRNA (Mensch) GAPDH.