In-Vivo-Plant-Imaging-System

Circadiane Rhythmen in Pflanzen

Verbessertes experimentelles Setup mit dem NightShade In-Vivo-Plant-Imaging-System. Circadiane Rhythmen in Arabidopsis thaliana Reporter-Linien lassen sich mit Hilfe des NightShade LB 985 In-Vivo-Plant-Imaging-Systems auf einfache Art analysieren.

Bild 1: Vertikale Messanordnung in der Dunkelkammer des NightSHADE LB 985 In-Vivo-Plant-Imaging-Systems. (Bild: Berthold Technologies)

Circadiane Uhren besitzen in Mehrzellern eine natürliche Variation, sowohl auf dem Niveau von Individuen und Geweben als auch in Zellen [1,2]. In der In-vivo-Analyse circadianer Rhythmen resultiert dies oftmals in verrauschten und ungenauen Messwerten. Deshalb ist eine gewisse Prozessrobustheit erforderlich, um zentrale Fragen der circadianen Biologie zu untersuchen. Aus diesem Grund haben wir ein einfaches Protokoll zur Analyse circadianer Rhythmen in Arabidopsis thaliana Reporter-linien mit Hilfe des NightShade LB 985 In-Vivo-Plant-Imaging-Systems entwickelt. Durch das experimentelle Setup werden die Datenqualität verbessert, die Lumineszenz-Variation in Replikaten verringert und eine hohe Korrelation mit auf Modellannahmen basierenden Vorhersagen erzielt.

Wie wirkt sich Licht auf Uhr-Gene aus?
Biogene biologische Uhren bestimmen verschiedene, sich wiederholende tägliche Rhythmen. Sie befähigen Organismen dazu, sowohl Umweltveränderungen zu antizipieren wie auch ihre Physiologie in synchronisierter Form zu koordinieren und zu adaptieren, wodurch ihre biologische Fitness verbessert wird [3]. Bio-logische Uhren bestehen aus einem Netzwerk von Genen und empfangen sowohl Umwelt- als auch metabolische Signale, wodurch sie mit Tag-/Nachtzyklen synchronisiert bleiben. Im Gegenzug kontrollieren sie verschiedene Signalwege und stellen sicher, dass sie zu einer entsprechenden Tageszeit gestartet werden.

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Licht ist ein sogenannter Zeitgeber, der die Uhr wieder zurücksetzen kann. In der vorliegenden Arbeit haben wir uns die Auswirkungen von Licht auf das komplexe System von Uhr-Genen in Arabidopsis thaliana angeschaut, um die Mechanismen besser zu verstehen, durch die sich die biologische Uhr der Pflanze auf Veränderungen der Tageslänge einstellen kann.

Bild 2: A. thaliana pCCA1::LUC+ (leuchtend) und Col-0 Wildtyp (Negativkontrolle) Setzlinge 7 h nach Anschalten des Lichts (Start der Lumineszenz-Messung). (Bild: Berthold Technologies)

Reporter-Linien in Echtzeit beobachten
Zur Erforschung circadianer Rhythmen empfiehlt sich insbesondere die Beobachtung von Reporter-Linien in Echtzeit mit Hilfe eines sensitiven Imaging-Systems, bei denen der Promoter eines Gens von Interesse die Expression von Luciferase pGENE::LUC+ steuert [4].

In unserem experimentellen Ansatz haben wir zur Analyse der circadianen Rhythmen Arabidopsis-Setzlinge verwendet, die ein pCCA1::LUC+ Konstrukt tragen. Die acht Tage alten und auf kurze Tagesdauer eingestellten Setzlinge wurden für weitere acht Tage zur Aufzeichnung der Lumineszenz in die Messkammer des NightShade LB 985 In-Vivo-Plant-Imaging Systems (Bild 1) gestellt. Bei diesem optischen, modularen und einfach zu bedienendem In-vivo-Imaging-System handelt es sich um eine Spezialentwicklung zur In-vivo-Analyse von Pflanzen.

Das System ist mit einer lichtdichten Messkammer und einer gekühlten CCD-Kamera ausgestattet, um Lumineszenz- und Fluoreszenzmessungen an Gewebematerial, Setzlingen und ganzen Pflanzen durchführen zu können. Hierbei kann die Kamera an der Decke oder den Seitenwänden der Messkammer angebracht werden, was Aufnahmen sowohl von oben wie auch von der Seite ermöglicht. In letzterer Position der Kamera können mehrere Setzlinge parallel in natürlicher, aufrechter Orientierung beobachtet werden. Wichtige Umweltbedingungen wie Temperatur, Luftfeuchtigkeit oder Tageslicht können hierbei überwacht werden, wodurch eine kontrollierte Messumgebung geschaffen wird.

Bild 3: LUC-Reporteraktivität von A. thaliana pCCA1::LUC+ Setzlingen während kurzer Tageszyklen (8 h Licht/16 h Dunkelheit). (Bild: Berthold Technologies)

Die Lumineszenz-Messungen wurden an 10 bis 15 gepoolten Setzlingen in Dunkelheit und mit der Kamera in Deckenposition über 600 s (Binning, 1x1 High Gain) nach einer 120 s dauernden, der Photonenerfassung vorgeschalteten Dunkeladaption durchgeführt. Die Pflanzen wurden in horizontal orientierten Platten kultiviert und ca. 20 cm unterhalb der Kamera platziert, um eine optimale Signal-erfassung zu erzielen (Bild 2). Der Fokus der CCD-Kamera wurde manuell eingestellt.

Ergebnisse ermöglichen mathematische Vorhersage des Lichteinflusses
Durch die 120 s andauernde Dunkeladaption vor der Photonenmessung konnte das Auftreten von Autofluoreszenz des Chlorophylls verhindert werden, was sich durch das Ausbleiben von Signalen im Col-0 Wildtyp im Vergleich zu den Reportersetzlingen zeigt (Bild 2). Das sogenannte Circadian Clock Associated 1-(CCA 1-)Gen kodiert für einen Master-Regulator des zentralen circadianen Oszillators [6]. Das Gen wird zum Morgengrauen stark exprimiert und von der Abenddämmerung an und über die Nacht hinweg unterdrückt [6].

Die Aktivität des CCA 1 promoter::LUC+ wurde über acht Tage hinweg aufgezeichnet. Die Dauer der Oszillationen betrug 23,910 ± 0,004 h (Bild 3). Die Robustheit des Rhythmus´ zeigt sich im relativen Amplitudenfehler (Bild 4). Durch dieses experimentelle Setup konnten über die 24-h-Zyklen hinaus mathematische Vorhersagen des Lichteinflusses auf die circadiane Uhr der Pflanze über einen großen Bereich von Synchronisationszyklen hinweg überprüft werden, z.B. 8-, 13- und 16-h-Zyklen [5].

Bild 4: Der relative Amplitudenfehler demonstriert die Robustheit der circadianen Oszillation. (Bild: Berthold Technologies)

Fazit
Wir haben ein deutlich verbessertes, robustes Protokoll zur Durchführung circadianer Experimente unter Verwendung der NightShade LB 985 entwickelt. Die Ergebnisse unserer Untersuchungen an Arabidopsis thaliana Reporterlinien stimmen mit früheren Berichten überein und zeigen, dass das lichtempfindliche Gen-Netzwerk der Arabidopsis-Uhr die Pflanze befähigt, sich an saisonale Veränderungen der Tageslänge anzupassen. Darüber hinaus wird durch unser experimentelles Setup die Lumineszenzvariation zwischen Replikaten reduziert und eine starke Korrelation zu Modellvorhersagen gefunden. Die Datenqualität wird daher verbessert.

Literatur
[1] Endo, M. Curr Opin Plant Biol, 2016. 29: p. 44-49.
[2] Endo, M., et al. Nature, 2014. 515(7527): p. 419-422.
[3] Green, R.M., et al. Plant Physiol. 2002. 129: p. 576-584.
[4] Millar, A.J., et al. Plant Cell, 1992. 4(9): p. 1075-1087.
[5] De Caluwe, J., et al. J Theor Biol, 2017. 420: p. 220-231.
[6] Alabadi, D., et al. Curr Biol, 2002. 12(9): p. 757-761.

AUTOREN
Dr. Thomas A. Schild
Berthold Technologies GmbH & Co. KG

Dr. José Romário Fernandes de Melo
Dr. Christian Hermans
Prof. Dr. Nathalie Verbruggen
Laboratory of Plant Physiology & Molecular Genetics, Université Libre de Bruxelles

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