Molekülbewegungen analysieren

PyFRAP für Diffusionskinetiken

Das Programm „PyFRAP“ vermeidet vereinfachende Annahmen und analysiert Molekülbewegungen so besonders genau.

In FRAP-Assays wird gemessen, wie viel Zeit fluoreszente Moleküle brauchen, um ein ausgebleichtes Areal wieder auszufüllen – also wie schnell ein dunkler Bereich in einer Probe wieder hell wird. (Bild: Alexander Bläßle/FML)

WissenschaftlerInnen nutzen bereits seit über 40 Jahren sogenannte „FRAP“-Assays (FRAP: Fluorescence Recovery After Photobleaching), um Diffusionskinetiken zu messen. Das interdisziplinäre Team um Dr. Patrick Müller am Friedrich-Miescher-Laboratorium der Max-Planck-Gesellschaft in Tübingen zeigte kürzlich die Limitationen der bisherigen Analysemethoden für diese Experimente auf – und stellt in der Fachzeitschrift Nature Communications die frei verfügbare Software „PyFRAP“ vor, mit der Diffusionskinetiken besonders genau bestimmt werden können.

In FRAP-Assays wird gemessen, wie viel Zeit fluoreszente Moleküle brauchen, um ein ausgebleichtes Areal wieder auszufüllen – also wie schnell ein dunkler Bereich in einer Probe wieder hell wird. Die Auswertung der dabei entstehenden mikroskopischen Bilder ist allerdings alles andere als trivial: So hängen Molekülbewegungen unter anderem von der Beschaffenheit der Umgebung ab. Wird eine komplex geformte Struktur bei der Analyse mit einfachen Geometrien approximiert, liegen die errechneten Diffusionskoeffizienten schnell fernab der eigentlichen Werte. PyFRAP fungiert ohne solche vereinfachenden Annahmen und geht stattdessen von realitätsnahen, dreidimensionalen Strukturen aus. Auf deren Grundlage simuliert das Programm das Experiment numerisch und passt die Simulationen über klassische Algorithmen an die gemessenen Daten an.

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Dr. Alexander Bläßle, der Erstautor der Publikation, und seine Kollegen haben eine Vielzahl weiterer Quellen für Ungenauigkeiten identifiziert und bei der Entwicklung von PyFRAP berücksichtigt. Diese Akribie scheint sich auszuzahlen: Im Vergleich mit Alternativprogrammen liefert PyFRAP gerade unter schwierigen Bedingungen besonders zuverlässige Ergebnisse. Und dank der flexibel festlegbaren Ausgangsbedingungen lassen sich mit dem Programm auch iFRAP-Daten (iFRAP: inverse FRAP) auswerten; eine relativ neue Alternative zu FRAP-Assays, die schonender für empfindliche Proben ist.

Mit dieser genauen Analysemethode könnten sich nun auch neue Anwendungsmöglichkeiten für FRAP- bzw. iFRAP-Assays auftun. Als Beispiel führen die Autoren in ihrer Publikation die Analyse von Molekülinteraktionen im lebenden Organismus auf: Hier könnte die Abbremsung von Molekülen ein Indiz für – eventuell unbekannte – Bindungspartner sein.

PyFRAP hat nach Ansicht der Autoren das Potenzial, sich als neues Standardprogramm in der Grundlagenforschung zu etablieren – und ist für sie ein eindrucksvolles Beispiel dafür, dass es sich lohnt, vereinfachende Annahmen zu hinterfragen und alternative Wege zu gehen.

Software: Das Programm PyFRAP steht kostenlos unter folgenden Links zur Verfügung: www.fml.tuebingen.mpg.de/mueller-group/software.html.

Originalpublikation: Bläßle A, Soh G, Braun T, Mörsdorf D, Preiß H, Jordan BM, Müller P (2018). Quantitative diffusion measurements using the open-source software PyFRAP. Nature Communications, DOI: 10.1038/s41467-018-03975-6.



Quelle: Max-Planck-Forschungsgruppe „Systembiologie der Entwicklung“

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