Peakrecycling verlängert die Trennstrecke Ihrer Säule. Die meisten Anwender präparativer Chromatographie kennen den Begriff, wissen aber nicht immer, wann diese Speziallösung für sie interessant sein kann. Beim Peakrecycling werden die eluierenden Substanzen wieder auf die Trennsäule zurückgeführt. Kritische Peakpaare, die ineinander laufen, können so voneinander getrennt werden. Einzige Voraussetzung für den Einsatz des Peakrecycling ist eine isokratische Trennmethode, da die Eluenten-Zusammensetzung auch bei mehrfacher Wiederholung des Vorgangs konstant sein muss.

Das präparative HPLC-System besteht aus einem Injektionssystem, einer präparativen Pumpe, einer präparativen Säule, einem Detektor und einem Fraktionierventil. Chromatographie-Säulen für den präparativen Maßstab können sehr kostenintensive Investitionen sein. Daher wird versucht, den besten Kompromiss zwischen entstehenden Kosten und erzielter Trennfähigkeit zu finden. Das Trennproblem und die Anforderungen an die Aufreinigung geben die Rahmenbedingungen vor. Komplexe Trennprobleme können dabei sehr schnell zu teuren und somit wenig wirtschaftlichen Lösungen führen. Wenn Spezialphasen oder kleinere Partikelgrößen zur effizienten Aufreinigung nötig sind, ist nicht nur der Kostenfaktor für die präparativen Säulen limitierend, sondern auch die Systemvoraussetzungen. Eine überraschend einfach umzusetzende Möglichkeit, die Trennleistung seines bestehenden Systems zu erhöhen, ohne dabei größere Investitionen zu tätigen, bietet das Peakrecycling.

Technische Voraussetzungen
Der Begriff „Recycling“ oder auch „Recycling Modus“ wird für die Beschreibung verschiedener Arten des Recycling verwendet:

• Zeitbasiertes Peakrecycling: Dieser Modus ist nicht automatisiert, aufwändiger in der Erstellung der Methode und lässt sich mit jeder Chromatographie-Software umsetzen. Bei einer Retentionszeitverschiebung innerhalb der Trennung kann es zu Unterschieden in der Reinheit verschiedener Fraktionen kommen.
• Automatisiertes Peakrecycling: Die Software steuert das Recycling abhängig von der Peakhöhe und/oder der Steigung. Dieser automatisierte Modus ist nur mit speziellen Softwarepaketen möglich (zum Beispiel OpenLAB CDS EZChrom Edition) und bietet hierbei größtmöglichen Komfort und Sicherheit.
• Solventrecycling: Als zusätzliche Option bieten einige Softwarepakete (z.B. ClarityChrom Prep, PurityChrom) die Möglichkeit des Solventrecycling. Dabei wird das Lösungsmittel, abhängig vom Detektorsignal oder zeitbasiert, wieder in den Eluentenvorrat zurückgeführt. Dies kann die Betriebskosten einer Anlage erheblich senken.

Bild 2: Vergleich der Trennungen von (+/–)-α-Tocopherol an teurem Säulenmaterial 5 μm (rote Kurve) und günstigerem Säulenmaterial 10 μm (schwarze Kurve) mit Hilfe des Peakrecycling.

Um den Recyclingmodus realisieren zu können, werden lediglich ein Multipositionsventil und ein T-Stück benötigt. Das Ventil wird über einen Port (meist ist dies der vorletzte Port des Ventils) mit dem T-Stück in der Systempumpenzuleitung verbunden. Soll das System vom normalen Betrieb in den Recyclingbetrieb übergehen, wird dieses Ventil auf die Recycling-Position geschaltet. Die Pumpe zieht den Eluenten nicht mehr aus dem Vorratsgefäß, sondern über das gesamte System (s. Bild 1).

Die Probe wird so lange im Kreis gefördert, bis das Ventil auf eine Fraktionierposition oder die „Waste“-Position geschaltet wird.

Peakrecycling: Applikation
Die Trennung zweier Isomere des (+/–)-α-Tocopherols ist ein gutes Praxisbeispiel für die Optimierung der Trennung mittels Peakrecycling. Im Vergleich zur analytischen HPLC sind die Möglichkeiten zur Optimierung der Applikation beim Aufreinigen stärker beschränkt. Für präparative Anwendungen im Reversed-

Phase-Modus reduziert sich die Auswahl an Säulenmaterialien auf Standardphasen mit einer Partikelgröße von 10 µm oder mehr. Solche präparativen Säulen mit einem Innendurchmesser von 20...100 mm haben zwar eine schlechtere Trennleistung, erzeugen aber einen erheblich geringeren Gegendruck bei hohen Flussraten als analoge Säulen mit geringerer Partikelgröße.

Stellt sich (wie beim Tocopherol) ein schwieriges Trennproblem dar, bei dem die Zielsubstanz sehr eng mit der unerwünschten Substanz eluiert wird, kommt der Anwender schnell an die Grenzen seiner Möglichkeiten (Bild 2). Spezialphasen, die zu einer besseren Trennung führen, und die erforderlichen Hochleistungspumpen stehen nicht im Verhältnis zu den Kosten. Doch ein Kompromiss mit in der Regel verschlechterter Trennleistung ist gar nicht notwendig. So lassen sich auch mit kostengünstigen Materialien (≥10 µm) unter Verwendung der richtigen Technik sehr gute Trennergebnisse erzielen.

Bei der Aufreinigung des (+/–)-α-Tocopherols unter Standardbedingungen bezahlt der Anwender eine hohe Ausbeute mit einer geringen Reinheit und umgekehrt. Durch die Verlängerung der Trennstrecke mittels Peakrecycling kann nach drei Recyclingzyklen bereits eine Basislinientrennung erzielt werden (Bild 2, schwarz). Die Fraktionierung kann so ohne Kompromiss zwischen Reinheit und Ausbeute erfolgen.

Fazit
Peakrecycling verbessert deutlich die Trennung der Isomere des α-Tocopherols durch eine „virtuelle“ Verlängerung der Trennsäule. Reinheit und Ausbeute sind vergleichbar zur Trennung mit deutlich teurerem Säulenmaterial (siehe Bild 2).

Eine Standard-HPLC-Anlage kann mit wenigen Handgriffen für den Einsatz von Peakrecycling umgerüstet werden. Systeme der Berliner Firma Knauer sind aufgrund ihres modularen Aufbaus ideal für die Verwendung und Optimierung solcher Techniken geeignet. Komponenten wie ein Multipositionsventil zur Schaltung zwischen Fraktionier- und Recyclingmodus können einfach nachträglich in das System integriert werden.

Dr. Christian Benkhäuser
Produkt Manager Präparative HPLC

Hagen Schlicke
Application Specialist
Knauer Wissenschaftliche Geräte GmbH

Vitamin E und Tocopherol
Vitamin E umfasst eine Gruppe von fettlöslichen Substanzen. Dazu gehören auch acht Varianten des Tocopherols, von denen die biologisch aktivste Form α-Tocopherol ist. Nur die biologisch aktiven Formen sind für die Lebensmittelindustrie relevant. Anwendung findet α-Tocopherol vorwiegend in der Lebensmittelindustrie als E307 und als Inhaltsstoff in Kosmetikprodukten. Zur Untersuchung ihrer Aktivität müssen die Stereoisomere mittels Chromatographie voneinander isoliert werden.