Life Sciences Innovations

Dynamische Lichtstreuung - ein perfektes Werkzeug für die Analytik therapeutischer Proteine

(Bild: fotolia / petarg)

Die Anwendung therapeutischer Proteine, häufig in Gestalt von monoklonalen Antikörpern, hat in den vergangenen Jahren eine rasante Entwicklung genommen. In der Folge wuchs auch der Bedarf für eine Analytik, die zuverlässig Auskunft über den Zustand der Präparate geben kann. Wir erläutern anhand von Beispielen, dass die dynamische Lichtstreuung hier gute Dienste leistet und damit auch in diesem Bereich sowohl in Forschung und Entwicklung als auch bei der Qualitätskontrolle von Wirkstoffen ein wertvolles Werkzeug ist.

Die Thematik
Seit einigen Jahren kann man beobachten, wie eine besondere Familie von Proteinen ihre Nischenexistenz als Forschungsgegenstand für eine kleine Gruppe von Wissenschaftlern verlässt und zunehmend in den Fokus einer interessierten Öffentlichkeit tritt. Die Rede ist von Antikörpern. Dabei handelt es sich um eine bestimmte Klasse von Immunglobulinen. Ihre angestammte Funktion liegt in der Erkennung und der Mitwirkung bei der Abwehr von Bakterien, Viren oder anderen Strukturen, die vom Immunsystem als fremd eingeordnet werden. Aber nicht nur Eindringlinge von außen nehmen die Antikörper ins Visier, sondern beispielsweise auch körpereigene, aber entartete Zellen, was den Körper vor dem Entstehen von Tumoren bewahrt.

Die Bindung eines Antikörpers an eine Struktur, üblicherweise wiederum ein Protein auf der (Zell-)Oberfläche des zu attackierenden Gegners, erfolgt dabei hoch spezifisch, das heißt, in der Regel hat ein Antikörper genau eine Zielstruktur, die er "erkennt". In unserem Körper zirkulieren ständig unzählige Antikörper mit ebenso vielen Spezifitäten, die einen permanenten, lautlosen Kampf gegen immer neue Gegner führen. Seit den bahnbrechenden Arbeiten von Köhler und Milstein in den 1970er Jahren (Nature. Bd. 256, S. 495-497, 1975) ist man in der Lage, eine nahezu beliebige Menge von Antikörpern mit genau gleicher, definierbarer Spezifität zu erzeugen, so genannte monoklonale Antikörper. Nachdem einige grundlegende technische Hindernisse beseitigt wurden, setzt man diese in therapeutischen Präparaten ein, so beispielsweise bei verschiedenen Krebs- und Autoimmunerkrankungen oder gegen Allergien. Auch zur Verhinderung der Abstoßung von Transplantaten bedient man sich ihrer Wirkung. Allerdings sind Antikörper wie die meisten Eiweißstoffe sehr empfindlich und bilden leicht unerwünschte Aggregate. Diesen Umstand muss man besonders bei der Qualitätskontrolle im Auge behalten, denn die Aggregate können ein solches Medikament unbrauchbar machen.

In diesem Anwendungsbericht zeigen wir, wie man die Dynamische Lichtstreuung (DLS) einsetzen kann, um die Qualität von Antikörper-Präparaten zu prüfen, Aggregate aufzuspüren und sich ein Bild von der Stabilität der jeweiligen Formulierung zu machen.

Fragestellung
Monoklonale Antikörper werden häufig lyophilisiert, um sie lagerfähig zu machen und später in gewünschter Konzentration für die Anwendung erneut zu lösen. Dieser Vorgang wird zwar so schonend wie möglich ausgeführt, jedoch kommt es dabei dennoch oft zur Bildung von Proteinaggregaten. Auch die vielfach angestrebten hohen Wirkstoffkonzentrationen können einen verstärkenden Einfluss auf die Bildung von Oligomeren und Aggregaten ausüben. Da auch das Lösemittel Einfluss auf die Stabilität einer solchen Präparation nehmen kann, wurde dieser Effekt für einen der beiden  Antikörper ebenfalls untersucht.

Methodik
In der vorliegenden Untersuchung wurden unterschiedliche Antikörperpräparate mit dem DLS Instrument Wyatt DynaPro NanoStar vor und nach der Lyophilisierung untersucht und die Größe der Moleküle sowie ihr mittels Statischer Lichtstreuung gemessenes Molekulargewicht verglichen. Außerdem erfasste die Messung den jeweiligen Anteil der Fraktionen an der Gesamtmenge. Die Auswertung erfolgte mithilfe spezieller Algorithmen der Dynamics Software.

Resultate und Interpretation
Bei den untersuchten Proben kam es in der DLS-Messung zu einem veränderten, deutlich nach rechts verschobenen Verlauf der Messkurven ("shift of decay rates"), wie auf Bild 1 zu sehen ist. Diese Veränderung ist auf die Bildung von Aggregaten zurückzuführen. Man kann sich das in etwa so vorstellen: Im Vergleich zu einer reinen Monomerlösung ist durch die Anwesenheit von Aggregaten die "durchschnittliche" Größe der Teilchen, die mittels DLS gemessen wird, leicht erhöht. Dies hat eine "Rechtsverschiebung" der Kurve zur Folge, wie sie das Bild zeigt. Auch das verwendete Lösemittel wirkt sich auf das Aggregationsverhalten der Probe aus. Man sieht, dass der in Phosphatpuffer (PBS) gelöste Antikörper nach der Lyophilisierung wesentlich weniger aggregiert ist als das andere, in Sucrose-haltigem Puffer gemessene Präparat.

In Bild 2 wird deutlich, dass die Aggregate im Vergleich zu den Monomerfraktionen bezogen auf ihren Massenanteil ein viel intensiveres Streulicht erzeugen. Aus der so genannten Prozent-Massen-Auswertung, einer speziellen Berechnungsfunktion der Dynamics-Software, ergibt sich für die aggregierten Antikörper in den beiden Präparaten, dass ihr jeweiliger Anteil an der Gesamtmasse lediglich 0,4 bzw. 1,2 % beträgt. Dennoch sind sie eindeutig nachweisbar.

Die thermische Stabilität einer Antikörperlösung lässt sich ebenfalls sehr gut mittels DLS untersuchen, indem man die Probe einem  ansteigenden Temperaturprofil aussetzt und währenddessen das Verhalten der Moleküle beobachtet. In den Bildern 3 und 4 sind Messungen der Schmelzpunkte zweier Antikörper in verschiedenen Pufferlösungen dargestellt. Der Beginn des Schmelzens ist durch die senkrechte gestrichelte Linie markiert. Während IgG_1 seine Stabilität bis zu einer Temperatur von knapp 67 °C beibehält, büßt IgG2 bereits deutlich früher, bei etwa 61 °C seine native Struktur ein. Die korrespondierenden Molekülradien zeigen, dass die hoch geordnete Struktur des Antikörperproteins, die aus energetischen Gründen nicht mehr aufrechterhalten werden kann, verloren geht und der Antikörper in einen quasi ungeordneten Zustand übergeht. In der Folge dehnt er sich räumlich stärker aus, weshalb durch die Lichtstreuung ein größerer hydrodynamischer Radius der Moleküle gemessen wird.

Man kann überdies auch noch weiter gehende Aussagen zum Verhalten der Makromoleküle treffen, wenn man deren Molekulargewicht kennt. Bestimmt man die Molekulargewichte allerdings allein mittels DLS, so werden diese nicht absolut, sondern anhand der Beziehung zwischen Radius und Masse berechnet. Daraus folgt eine gewisse Unsicherheit der Bestimmung, weil die aus dem hydrodynamischen Radius berechneten Daten von der tertiären Struktur des Proteins abhängen.

Um dieser Situation zu begegnen, verwendet das DynaPro NanoStar als einziges verfügbares DLS Instrument eine zusätzliche 90°-Streulichtdiode für die Statische Lichtstreuung (SLS). Mittels dieser wird das Molekulargewicht absolut aus der Gesamtmenge des Streulichtes bestimmt, und zwar ohne Annahmen über die Gestalt des Moleküls. Somit kann das Instrument simultan hydrodynamische Radien durch DLS und absolute Molekulargewichte mittels SLS messen. Mithilfe entsprechender Zusatzfunktionen der Dynamics-Software erhält man so einen wertvollen Zugewinn an Informationen. Daneben erlaubt die Software verschiedene Fitmethoden wie Starttemperatur und Wendepunktbestimmung, die beide automatisch erfolgen, und linear, was eine manuelle Auswertung erlaubt. Bild 5 zeigt eine solche Messung - wiederum an der Reaktion einer Antikörperlösung auf den Anstieg der Temperatur.

Man sieht einen besonderen Effekt, nämlich dass in dem Bereich kurz vor Erreichen des Schmelzpunktes das Molekülgewicht offenbar abnimmt. Wie kommt dies zustande? Die Erklärung ist in diesem Falle einfach: Die Lösung muss bereits bei Raumtemperatur einen substanziellen Anteil an Oligomeren enthalten haben. Als nun die Temperatur erhöht wurde, dissoziierten diese nach und nach, so dass sich diese "thermische Spaltung" in einem Abnehmen der Molekulargewichte messbar niederschlug. Mit Erreichen des Schmelzpunktes kehrte sich dieser Effekt freilich um, und zwei andere Vorgänge gewannen die Oberhand: Die Proteinstruktur brach zusammen und vergrößerte den gemessenen Radius (grün). Die rapide Aggregation trug ihren Teil zur Radiuserhöhung bei und sorgte außerdem für das Ansteigen des Molekulargewichts (blau).

Insgesamt erhält man also durch die Daten aus DLS und SLS eine umfassende Beschreibung sowohl der statischen Verhältnisse als auch der dynamischen Prozesse, die in einer Lösung von Makromolekülen existieren,  aus der kombinierten Betrachtung aller relevanten Parameter.

Schlussbetrachtungen
Die Betrachtungen zeigen eindrucksvoll die Bedeutung, welche die DLS beispielsweise bei der Qualitätskontrolle von monoklonalen Antikörpern haben kann, die als Therapeutika beim Menschen eingesetzt werden sollen. Hier gibt es strenge Vorgaben, wie groß - genauer gesagt wie klein der Aggregatanteil in der jeweiligen Charge sein darf, um eine gefahrlose Applikation sicher zu stellen. Diese Grenze liegt in der Regel im Bereich von sehr wenigen Prozenten, doch gilt hier natürlich grundsätzlich: Je weniger Aggregate, desto besser das Präparat. Genau dort spielt nun die DLS ihre Stärken besonders gut aus, denn damit lassen sich problemlos Größenordnungen von deutlich weniger als einem Prozent sichtbar machen. Zudem kann man das Verhalten der Wirkstoffe bei thermischen Veränderungen untersuchen. Dadurch gewinnt diese Methode das Potenzial, zu einem unverzichtbaren Werkzeug nicht nur in der pharmazeutischen Produktkontrolle zu werden.

Die gezeigten Daten wurden im Anwendungslabor von Wyatt Technology Europe mit einem Wyatt DynaPro NanoStar-Instrument (Bild 6) gemessen und mit der Dynamics-Software ausgewertet.

Autor:
Dr. Thomas Jocks
Wyatt Technology Europe GmbH

Anzeige
Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige