Tandem-Ionenmobilität und Tandem-MS gekoppelt

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Kopplung von Tandem-Ionenmobilität und Tandem-Massenspektrometrie für komplexe Fragestellungen in der Strukturaufklärung.
Bild 1: Select Series Cyclic IMS von Waters – QTOF Hybridmassenspektrometer mit integrierter zyklischer Ionenmobilitätstrennzelle (cIM). © Waters

Tandem-MS-Instrumente als Tandem-Quadrupol- oder Hybridinstrumente sind heute weit verbreiteter Standard in Rückstandsanalytik sowie Strukturaufklärung. Durch die Kopplung mit Ionenmobilität (IM) gewinnt man eine zusätzliche Dimension. Die Kombination von Masse zu Ladungs-Verhältnis und Stoßquerschnitt resultierend aus der Molekülform ist ein nützliches Werkzeug zur Trennung von Analyten aus kleinen Mengen heterogener Mischungen.

Wichtige Treiber für den Erfolg der Tandem-MS-Instrumente sind die Steigerung der Nachweisgrenzen (in der Regel mit Tandem-Quadrupol-Instrumenten) und der Einsatz in der detaillierten Strukturaufklärung und Bestimmung der elementaren Zusammensetzung (in der Regel mit hochauflösenden Hybridmassenspektrometern (HRMS)). Dabei werden die Ionen von Interesse im ersten Massenfilter ausgewählt, anschließend fragmentiert und im zweiten Massenfilter analysiert. In den meisten Fällen erfolgt die Fragmentierung der Ionen mittels kollisionsinduzierter Dissoziation (CID) an einem Stoßgas, aber auch andere Fragmentierungstechnologien für spezifische Fragestellungen sind verbreitet, beispielsweise Elektroneneinfang- (Electron Capture Dissociation, ECD), Elektronentransfer- (ETD) und Infrarot-Photodissoziation (IRPD)).

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Die mit der Massenspektrometrie gekoppelte Ionenmobilität (IM-MS) ergänzt den analytischen Werkzeugkasten und liefert durch eine zusätzliche Trenndimension erhöhte Selektivität. So kann die IM u. a. zur Unterscheidung isobarer Spezies verwendet werden, wozu Massenspektrometrie allein nicht ausreicht. Zusätzlich kann durch IM-MS der Stoßquerschnitt (Collisional Cross Section, CCS) des Analyten bestimmt werden. Dieser physikochemische Parameter kann zur Strukturzuordnung genutzt werden, indem experimentelle Daten mit theoretisch berechneten CCS-Werten abgeglichen werden.

Bild 2: Zyklische Ionenmobilitätszelle (cIM), flankiert von Stoß- und Speicherzellen für Auswahl- und Fragmentierungsexperimente. Links: Trap Cell (Pre IM activation), Mitte (kleiner brauner Ring): Store (IMSn activation), rechts: Transfer Cell (Post IM activation). © Waters

Die Ionenmobilität basiert auf der Trennung von Molekülen entsprechend ihrer Masse zu Ladungs-Verhältnisse (m/z) und der reduzierten Mobilität K in einem Driftgas. Seitdem im Jahr 2006 das erste kommerzielle Gerät erhältlich war, wurde das Auflösungsvermögen R durch kontinuierliche technische Weiterentwicklungen enorm verbessert. Das Auflösungsvermögen R von IM-MS-Instrumenten kann anhand der Trennleistung von zwei Spezies folgendermaßen beschrieben werden: R = CCS/ΔCCS.

Bild 3: Trennung der isomeren Trisaccheride Melezitose, Raffinose und Maltotriose bei 5 und 50 Trennzyklen. © Waters

2019 wurde das „SELECT SERIES Cyclic IMS“ von Waters auf den Markt gebracht – mit einem neuen Konzept für ein schnell-scannendes Ionenmobilitäts-QToF-Massenspektrometer mit einer Massenauflösung bis 100 000 (FWHW) (Bild 1). Die zyklische Ionenmobilitätszelle (cIM) als Kern des Instruments macht neuartige Kopplungsexperimente von Tandem-MS und Tandemionenmobilität möglich (Bild 2). Mit dem Cyclic IMS ist Ionenmobilität skalierbar, so dass die Auflösung der Ionenmobilitätstrennung den Anforderungen flexibel angepasst werden kann. Dies wird erreicht durch die kreisförmige Ionenmobilitätszelle, auf der die Ionen beliebig viele Trennzyklen durchlaufen können. Experimentelle Daten ergaben ein Auflösungsvermögen von R = 65 bei einem Umlauf bis R ~ 500 für die isomeren Trisaccharide Melezitose und Raffinose bei 50 Trennzyklen. In einer Forschungsarbeit wurden Auflösungen von R > 750 erreicht [1]. Dabei ist zu bedenken, dass die Auflösung proportional zur Quadratwurzel der Trennzyklen n ist (R ~ √n). Beachtenswert ist die beginnende Trennung der Anomere von Maltotriose (Bild 3), die eindrucksvoll auf die Möglichkeiten zur Untersuchung isomerer Strukturen in der Gasphase hindeutet. Skalierbare Ionenmobilitätsauflösung ist somit für die Strukturaufklärung isomerer Strukturen und Untersuchung von Konformeren, aber auch für die Analyse komplexer Gemische, eine leistungsfähige Technologie.

Tandem-MS, Tandem-IM und deren Kombination als IMSn

Für Strukturaufklärung werden ergänzend zur HRMS zusätzliche Tandem-MS-Experimente genutzt, um Informationen über Substrukturen zu gewinnen. Dafür werden die Ionen von Interesse mit dem Quadrupol ausgewählt, einer Fragmentierung unterworfen und dann mit hoher Auflösung und exakter Masse aufgenommen. In der Darstellung der Geometrie des Instruments ist der Quadrupolmassenfilter (Q) nach dem „StepWave Ion Guide“ zu erkennen (Bild 1). Eine Detaildarstellung in Bild 2 zeigt, dass die zyklische Ionenmobilitätszelle (cIM) von Stoß- und Speicherzellen flankiert wird. Ionen können aus dem Ionenpfad orthogonal in die cIM hinein und zurück überführt werden. Dabei werden die Ionen in einem typischen Experiment nach erfolgreicher IM-Trennung in der cIM mittels ToF-Analyzer gemessen.

Durch das Zurückführen ausgewählter Ionen aus dem cIM in die Speicherzelle „Store“ sind neuartige Experimente durchführbar. Somit können die in IM-Trennbanden vorhandenen Ionen selektiv herausgeschnitten und entgegen ihres vorherigen Weges im „Store” gespeichert werden (sog. Slicing). Das Auswählen von Ionen aus IM-Trennbanden (Slicing), Zurückführen sowie Speichern dieser im „Store“ und erneutes Überführen in die cIM ermöglicht Tandem-IM. Die Wiederholung dieser Auswahlschritte ist nicht limitiert und IM-Trennungen können nach Belieben erfolgen (IMn). Mit Hilfe dieser IMn-Experimente lässt sich eine besonders hohe Selektivität erreichen.

Eine Aktivierung der Ionen für Fragmentierungsreaktionen kann in den Stoßzellen und dem Store erfolgen (s. Bild 2). Bei Nutzung des Quadrupolmassenfilters mit anschließender Fragmentierung können Tandem-MS-Experimente durchgeführt werden. Weiterhin können sowohl Vorläufer- als auch Fragmentionen mit der cIM anhand ihrer Stoßquerschnitte untersucht werden. Somit ergeben sich unbegrenzte Kombinationsmöglichkeiten von Fragmentierungsreaktionen MS/MS und IM/IM- Trennungen, die der Einfachheit halber mit IMSn bezeichnet werden.

IMSfür Strukturaufklärung in komplexen Proben

Bild 4: Links: Ausschnitt aus dem Massenspektrum von Eozän-Rohöl m/z 400 – 500, rechts: Massenspektrum des Isolationsfensters m/z ± 0,5 Da für m/z 436 – 436,5. © Waters

Die Strukturaufklärung komplexer Proben mittels klassischer Tandem-MS kann erschwert sein, da der Quadrupolmassenfilter durch die limitierte Auflösung Vorläuferionen im Bereich von 0,5 – 1 Da selektiert. Somit werden eine Vielzahl von Analyten sehr ähnlicher Masse und isomere Strukturen gleicher Masse für die Tandem-MS isoliert. Dadurch können die Signale der Fragmentionen im Massenspektrum oftmals nicht eindeutig dem Vorläuferion zugeordnet werden. Hinzu kommt, dass häufig nicht das Ion mit der höchsten Intensität primäres Ziel der Strukturaufklärung ist.

Ein typisches Beispiel ist die Strukturaufklärung von Rohölbestandteilen, als Teil des Fachgebiets „Petroleomics“. Komplexe und für die Strukturaufklärung „unsaubere“ Fragmentionenspektren („Mischspektren“) resultieren aus einer stark zunehmenden Anzahl von Isomeren mit steigender Kohlenstoffanzahl und dem zusätzlichen Auftreten mehrerer Signale mit geringem Massenunterschied innerhalb eines Isolationsfensters [2]. Bild 4 veranschaulicht dies durch einen genaueren Blick ins Isolationsfenster von m/z 436 bis 436,5. Darin sind neben den drei Hauptsignalen mit einer Massendifferenz von nur ca. 90 mDa ebenfalls vier weitere schwächere Signale (mit * gekennzeichnet) zu sehen. Hier erweisen sich klassische Tandem-MS-Experimente für die Strukturaufklärung als ungeeignet. Die Trennung der im Quadrupol isolierten Vorläuferionen wird durch wiederholte IM-Experimente (IMn) mittels Slicing ermöglicht. Eine nachfolgende Fragmentierung (IMSn) liefert anschließend die für die Strukturaufklärung erforderlichen sauberen Fragmentionenspektren.

Neben den genannten isomeren Oligosacchariden und den komplexen Ölproben gibt es eine Vielzahl weiterer Beispiele für komplexe Proben und isomere Verbindungen, deren Strukturuntersuchungen durch IMSn-Experimente erleichtert oder gar erst ermöglicht werden. Das gilt insbesondere für Fälle, in denen die chromatographische Trennung aufgrund der Probenkomplexität nicht ausreicht oder nicht durchführbar ist. Zu diesen Anwendungen gehören zum Beispiel Sekundärmetabolite, Steroide, Lipide, Peptide und Polymere sowie strukturbiologische Untersuchungen von Proteinen, Proteinkomplexen und Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Experimente (HDX).

Alternative Fragmentierungstechnologien für die Strukturaufklärung

Bild 6: Vergleich der Massenspektren von nativem Streptavidin mit CID und SID. Spektrum oben mit CID bei 80 V zeigt überwiegend Monomere mit höherem Ladungszustand (1 500 – 2 250 m/z); Einsatzbild: Natives Streptavidin Tetramer ohne Aktivierung. Unteres Spektrum mit SID bei 40 V zeigt nach Fragmentierung eine gleichmäßigere Verteilung auf die Ladungszustände und beinhaltet Monomere, Dimere und Trimere als Produktionen. © Waters

Für spezielle Untersuchungen von Biomolekülen sind zusätzliche Fragmentierungstechnologien hilfreich. Neben der Fragmentierung an einem Stoßgas (CID) sind mit dem „Cyclic IMS“ auch Elektroneneinfangdissoziation (ECD) und oberflächeninduzierte Dissoziation (Surface Induced Dissoziation SID) möglich. Letztere Technik wird vor allem in der nativen Massenspektrometrie eingesetzt, um Verbindungen zwischen den Untereinheiten in Proteinkomplexen zu bestimmen. SID liefert im Vergleich zur kollisionsinduzierten Dissoziation (CID) eine breite Palette an Produktionen, die in stöchiometrischer Relation zu den nativen Unterkomplexen stehen. Durch CID hingegen ist die Informationstiefe wesentlich geringer, da überwiegend höher geladene monomere Einheiten erhalten werden. Der Vergleich dieser beiden Fragmentierungstechniken ist in Bild 6 anhand des nativen Proteinkomplexes von Streptavidin (53 kDa) dargestellt. Die Zuordnung der Spektren wird durch die anschließende IM-Trennung der Produktionen in überlappenden m/z-Bereichen erheblich erleichtert (Bild 7).

Bild 7: Trennung der Produkt-Ionen nach SID mittels zyklischer Ionenmobilität für eine einfachere Zuordnung. Die unterschiedlichen Zonen mit Produkt-Ionen der gleichen Ladungszustände überlappen sich in m/z-Bereichen, werden aber durch die Ionenmobilität in Drift- vs. m/z-Bereiche getrennt (gekennzeichnet mit Ellipsen). © Waters

Bei der Zuordnung von SID-Spektren können Produktionen mit geringer Intensität oft übersehen werden, da diese von Ionen hoher Intensität überlagert werden. Der Einsatz der Ionenmobilität nach SID ermöglicht die Trennung der Produktionen anhand ihrer Ladung und Form. Die Darstellung von Drift versus m/z vereinfacht die Zuordnung deutlich im Vergleich zur alleinigen m/z-Dimension.

Zusammenfassung

Als Massenspektrometer mit Tandem-IM eröffnet das Select Series Cyclic IMS neue experimentelle Möglichkeiten für die Strukturaufklärung. Besondere IMSn-Experimente sind durch die multiple Kombination von Tandem-MS und Tandem-IM möglich, wobei die Ionen in der Tandem-MS mit CID, ECD, SID und Kombinationen derer fragmentiert werden können. Zahlreiche Forschungsvorhaben in der Strukturaufklärung von komplexen Proben, von isomeren Verbindungen und bei strukturbiologischen Fragestellungen konnten bereits mit Hilfe der beschriebenen Technologie erfolgreich zum Abschluss gebracht werden.

Literatur
[1] D. Ropartz, M. Fanuel, J. Ujma, M. Palmer, K. Giles, H. Rogniaux, Anal. Chem. 2019, 91, 12030−12037
[2] E. Cho, E. Riches, M. Palmer, K. Giles, J. Ujma, S. Kim, Anal. Chem. 2019, 91, 22, 14268–14274

AUTOR
Dr. Gunnar Weibchen
Waters GmbH
Tel.: 06196/400-600
deutschland@waters.com
www.waters.com

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