LC-MS mit integrierter Probenvorbereitung

Bestimmung von monoklonalen Antikörpern nach tryptischem Verdau auf Nanopartikeln

Die Bestimmung monoklonaler Antikörper kann mit einem LC-MS-System, das mit einem Probenvorbereitungs-Kit kombiniert ist, erleichtert werden. Genaueres hierzu erläutert Dr. I. Spenner von Shimadzu in ihrem Artikel.

Bild 1: Wirkungsweise von monoklonalen Antikörpern. © Shimadzu

Ob in der Behandlung von Rheuma oder Krebs – monoklonale Antikörper sind zentrale Therapiebausteine der modernen Medizin. Doch die komplexen Strukturen der Peptide machen eine Analytik der Wirkstoffe herausfordernd. Moderne LCMS-Methoden können dabei unterstützen und manuelle Probenvorbereitungsschritte durch spezielle Nanopartikel verringern.

Der modernen Medizin gelingt es immer mehr, ein fortgeschrittenes Verständnis von Krankheiten auf molekularer Ebene zu gewinnen. Diese neuen Erkenntnisse der Grundlagenforschung haben in der biopharmazeutischen Industrie die Forschung, Produktion und Herstellung von monoklonalen Antikörpern (mAbs) erheblich verstärkt. Tatsächlich waren fünf der zehn meistverkauften Medikamente in den USA im Jahr 2016 mAbs. mAbs werden bereits heute für die Behandlung lähmender und lebensbedrohlicher Krankheiten eingesetzt, wie rheumatoide Arthritis, Morbus Crohn, Plaque-Psoriasis und Colitis Ulcerosa. Sie bekämpfen auch bestimmte Arten von z. B. Darm-, Lungen-, Eierstock- oder Magenkrebs.

Wirkungsweise von mAbs

Greifen Fremdstoffe den menschlichen Körper an, produziert das Immunsystem eine große Anzahl von Antikörpern, also Proteine, die im ganzen Körper zirkulieren, bis sie bestimmte Fremdstoffe, sogenannte Antigene, finden und an sich binden. Danach kann das Immunsystem den Antigen-Antikörper-Komplex zerstören.

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Der medizinischen Forschung ist es gelungen, spezielle Biomarker von Krebszellen ausfindig zu machen. Die Forscher stellen dann im Labor mAbs gegen genau diesen Biomarker her, um damit die Krebszelle zu bekämpfen. Die mAbs sind quasi künstliche Ersatzantikörper, die den Angriff des Immunsystems auf krankheitserregende Zellen wiederherstellen, stärken oder nachahmen. mAbs können zwischen gesunden und kranken Zellen unterscheiden. Diese gezielte Therapie greift die Krebszellen an, ohne die normalen Zellen zu schädigen, was zu weniger Nebenwirkungen für die Patienten führen kann (s. auch Bild 1).

Analyse von mAbs

Für die gezielte Wirkung der mAbs ist einiges an Entwicklungsarbeit notwendig. So werden beispielsweise die Wirksamkeit und Toxizität, die Absorption und Verteilung, der Stoffwechsel und die Ausscheidung bestimmt.

Die Bioanalyse von mAbs greift dabei oft auf die ELISA-Methode zurück (enzyme-linked immunosorbent assay). Diese enzymatischen Schnelltests werden häufig zum Nachweis und zur Quantifizierung von Biotherapeutika wie Antikörpern eingesetzt. Es gibt jedoch kritische Probleme in Bezug auf Wirksamkeit und Effizienz des ELISA, einschließlich der Einflüsse von Kreuzreaktionen und hemmenden Substanzen, die zu Falschbefunden führen können.

LC-MS als Alternative für die Bestimmung von mAbs

Um die Probleme der Schnelltests zu umgehen, ist die Flüssigchromatographie mit massenspektrometrischer Detektion (LC-MS) eine ideale Methode. Durch die strukturindizierte Analyse im LC-MS lassen sich die Probleme der ELISA-Tests umgehen. Zudem können LC-MS-Geräte aufgrund ihrer Genauigkeit und Empfindlichkeit auch kritische Messungen durchführen. Allerdings steigt dagegen der Aufwand für die Probenvorbereitung. Die mAbs müssen dabei denaturiert, reduziert und alkyliert sowie anschließend enzymatisch verdaut werden.

Selbst in der Detektion gibt es einige Hindernisse. So ist gerade bei großen Proteinen wie Antikörpern eine Analyse erst nach einer Aufspaltung in eine große Anzahl kleinerer Peptide, darunter die Signaturpeptide, möglich. Sie erhöhen das Hintergrundrauschen und die Ionisationsunterdrückung und werden zu einer großen Herausforderung im LC-MS-System.

Einfachere LC-MS-Analyse mit Kit-Systemen

Bild 2: Schema zum Verdau der monoklonalen Antikörper mittels Nanopartikeln. © Shimadzu

Um Anwender bei der Analyse dieser komplexen Gemische zu unterstützen, sind mittlerweile spezielle Systeme für die mAb-Bioanalytik auf dem Markt, beispielsweise das nSMOL-Kit von Shimadzu. Durch sie entfallen Schritte der manuellen Probenvorbereitung, denn die Antikörper aus Blut oder anderen biologischen Proben werden mit einem speziellen Immunglobulin-Sammelharz gebunden – ähnlich wie bei einem Ionenaustauscher. Damit können sie auf dem Material aus den Medien abgetrennt und aufgereinigt werden. Mit Hilfe von speziellen enzymbeschichteten Nanopartikeln ermöglicht das nSMOL-Kit dann einen selektiven enzymatischen Verdau der Fab-Region (s. hierzu Bild 2; Fab = antigenbindendes Fragment). Die gesammelten Fab-basierten Peptide lassen sich anschließend leicht durch MRM-Messungen mit einem LC-MS-System quantifizieren.

Fazit

Die Analytik von mAbs ist für die Entwicklung und Überwachung neuartiger Medikamente unverzichtbar. Die LC-MS in Kombination mit Kits kann dabei die Probenvorbereitung drastisch vereinfachen. Im Vergleich zur herkömmlichen LC-MS-Analytik eliminieren solche Kit-Systeme die Schritte der Denaturierung, Reduktion und Alkylierung, die normalerweise mit dem Proteinaufschluss verbunden sind. Das ermöglicht eine effizientere Probenvorbereitung und -analyse. Darüber hinaus werden Hintergrundrauschen und Ionenunterdrückung drastisch reduziert, was zu einer verbesserten Reaktion und quantitativer Wiederholbarkeit führt.

Dabei haben die Systeme eine breite Anwendbarkeit, unabhängig von der Art der zu analysierenden Antikörper-Medikamente, und zeichnen sich durch eine hohe Reproduzierbarkeit aus. So ermöglichen sie eine schnelle Methodenentwicklung bei geringeren Anschaffungskosten.

AUTORIN
Dr. Isabelle Spenner
Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg
info@shimadzu.de
www.shimadzu.de

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