Methodenentwicklung in der organischen Spurenanalytik

Teil 2: Detektion

Bei der Entwicklung einer analytischen Methode dreht sich alles um die Gewinnung einer ausreichend hohen Selektivität. Die letzte Gelegenheit, mehr davon in eine Analysenmethode zu bringen, stellt das Detektionsverfahren dar. Gerade an dieser Stelle können auch die größten Selektivitätssprünge erzielt werden. Als selektiv bezeichnete Detektoren „sehen“ nur solche Messgrößen (z.B. definierte Strukturen oder Elemente), welche die möglichen Analyten stark einschränken und erlauben so die erwünschte Diskriminierung von Störstoffen.

Im Teil 1 dieses Artikels wurden die Möglichkeiten erläutert, schon bei der Probennahme und insbesondere bei einem spezifischen Aufreinigungsverfahren Selektivität aufzubauen. Auch die vielfältigen und potenten Verfahren der anschließenden chromatographischen Trennungen wurden behandelt. Der abschließende Schritt – die Detektion – ist oftmals der wichtigste Faktor zur Optimierung der Selektivität und daher meist auch der apparativ aufwändigste.

Standard-Detektoren
In der GC reagiert der ECD (Electron Capture Detektor) sehr sensitiv hauptsächlich auf Elektronen einfangende (meist halogenhaltige) Analyten, während der sog. Thermionische Detektor (TID) praktisch nur auf organische Stickstoff- und/oder Phosphorverbindungen anspricht und daher in der Pestizidanalytik gerne als NPD bezeichnet wird. Heute weniger in praktischer Verwendung befinden sich der flammenphotometrische GC-Detektor (FPD), der die Chemilumineszenz von Schwefel bzw. Phosphor nutzt, und der Plasma-Atomemis-sions-Detektor (AED; Echelle Plasma Emission Detector EPED), mit dem bevorzugt die Elemente Cl, Br, I, F und S erfasst werden.

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Bild 4: Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses um eine Zehnerpotenz durch Einsatz eines DMS-Moduls („SelexION“) vor dem Triple Quad (AB Sciex 6500) bei einer ausgewählten Pharma-Applikation (Salmeterol in Plasma). © AB Sciex

Die HPLC kann in dieser Beziehung hauptsächlich mit dem Fluoreszenz-Detektor (FLD) aufwarten, der sein enormes Potential bei fluoreszierenden Substanzen ausspielen kann. Durch zeitgesteuerte Programmierung der Anregungswellenlänge und geeignete Auswahl des Emissionsbereiches kann dieser LC-Detektor hochsensitiv auf z.B. PAHs, Afla-toxine, etc. reagieren, ohne von den vielen Begleitstoffen in der Spurenanalytik gestört zu werden. Ein Diodenarray-Detektor (DAD) kann nicht nur auf jede beliebige Wellenlänge eingestellt werden, sondern auch ohne Sensitivitätsverlust komplette Spektren erfassen (Bild 6, oben rechts).

Ionenmobilitäts-Spektrometrie
Bei der klassischen Ionenmobilitäts-Spektrometrie (IMS) wandern die in einer MS-Ionenquelle erzeugten Ionen in einer sogenannten Driftzelle gegen einen Gasstrom. Angetrieben werden sie dabei von einem elektrischen Feld. Ihre Geschwindigkeit bzw. die Wegzeit in der Driftzelle sind dabei unter anderem von der Masse, der Ladung und insbesondere von der Struktur der Analytionen abhängig. Die Geschwindigkeit verhält sich dabei proportional zum Produkt aus Feldstärke und dem substanzspezifischen Ionenmobilitätskoeffizienten K. Wichtig ist, dass K von der Form bzw. dem Querschnitt des driftenden Ions abhängig ist.

Bild 5: Time of Flight-System (Schema ohne Reflektor).

Bei der differenziellen Ionenmobilitäts-Spektrometrie (DMS) wird zusätzlich die Feldabhängigkeit von K ausgenutzt. Der DMS-Analysator besteht im Wesentlichen aus zwei parallelen Elektroden, an die eine asymmetrische Wechselspannung quer zum Transportgasfluss angelegt wird. Die differentielle Ionenmobilitäts-Spektrometrie trennt die Ionen aufgrund ihrer unterschiedlichen Mobilität unter dem Einfluss eines elektrischen Wechselfeldes. Diese Technik kann auch als eigenständiger Detektor (z.B. GC-DMS) verwendet werden. Besonders interessant wird sie jedoch als Kopplungsvariante mit der Massenspektrometrie.

Die DMS stellt in der LC-MS ein zusätzliches Trennglied dar, das aufgrund eines zusätzlichen Trennprinzips die Gesamtselektivität erhöht und bei geeigneten Problemstellungen Steigerungen der Sensitivität zu leisten vermag. Als orthogonale Gasphasentrenntechnik zwischen HPLC und Massenspektrometer positioniert (Bild 4), kann DMS helfen, isobare und isomere Analyten zu trennen und damit noch mehr Selektivität in ein LC-MS zu bringen (LC-DMS-MS/MS).

Bild 6: Detektionsvarianten im optischen Bereich (oben) bzw. in der Massenspektrometrie (unten). Der Informationsgehalt nimmt immer von links nach rechts deutlich zu.

Massenspektrometrie
Eine zusätzliche Dimension an molekülselektiver Detektion eröffnet sich mit der Massenspektrometrie. Werden im Full-scan-Verfahren permanent komplette Massenspektren aufgezeichnet, können bei der Auswertung auch im Nachhinein beliebige Ionen (d.h. Masse/Ladungs-Verhältnisse), welche einer eingeschränkten Auswahl von bestimmten Strukturen entsprechen, am PC dargestellt werden. So werden Co-Eluierende in sog. Extrahierten bzw. Rekonstruierten Ionen-Chromatogrammen (XIC bzw. RIC) ausgeblendet. Durch Auswahl von diagnostischen Ionen wird hohe Selektivität für Einzelanalyten bzw. Substanz/Struktur-Klassen auf Knopfdruck individuell einstellbar. Diese frei wählbare Detektions-Selektivität kann durch zwei technische Erweiterungen noch einmal deutlich verbessert werden.

Die erste Variante ist die Hochauflösung (HRMS), d.h. die Steigerung der Massengenauigkeit zur sogenannten „Accurate Mass“-Technik (meist mittels Time of Flight; TOF).

Bild 7: Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (schematisch) in der meist benutzten Betriebsweise Multiple Reaction Monitoring (MRM) mit zwei Übergängen.

Das Prinzip des Flugzeitmassenspektrometers (TOF) beruht darauf, dass Ionen mit unterschiedlichem Masse/Ladungs-Verhältnis nach einer schnell gepulsten Beschleunigung in der Ionenquelle zwar die gleiche kinetische Energie, aber unterschiedliche Geschwindigkeiten haben. Leichtere Ionen werden stärker beschleunigt und sind daher schneller. Entsprechend ihrer Masse benötigen Ionen mit gleicher Ladung unterschiedlich lange zur Bewältigung einer bestimmten feldfreien Flugstrecke. Die Trennung erfolgt nach der Flugzeit (Bild 5). Dadurch können in kürzester Zeit (hohe Datenrate) komplette Spektren im „Full Scan“ bei guter Empfindlichkeit (hohe Transmission) von einem sehr schnellen Detektor aufgenommen werden. Extrem präzise Verfahren zur Zeitmessung kombiniert mit sehr konstanten Flugstreckenlängen durch Thermostatisierung und Spezialwerkstoffe mit sehr geringem Ausdehnungskoeffizienten ermöglichen die hochauflösende Massenbestimmung mit Massenfehlern im unteren ppm-Bereich.

Weitere Vorteile sind der kaum eingeschränkte Massenbereich, und durch die hohe Genauigkeit der Massenbestimmung wird die Berechnung aller Summenformeln möglich, welche zu der exakt bestimmten Molekülmasse passen. Reflectron-Typen verlängern durch „Ionen-Spiegel“ die Flugbahn und verbessern so die Auflösung (Bild 8 rechts). TOF-MS sind sehr gut geeignet für schnelle Chromatographie und typische „Non-target-screening“-Aufgaben. Durch die Kombination mit vorgesetzten Quadrupolen entstehen sehr leistungsfähige Tandem-Massenspektrometer (QqTOF/QTOF) mit Hochauflösung und höchsten Datenraten (Bild 8).

Bild 8: Bauelemente eines state-of-the-art Q-TOF Tandem-Massenspektrometers für die LC mit Darstellung der Hochauflösung (ca. 35 000 bzw. 2 ppm; rosa) im Vergleich zur Quadrupol-Nominalauflösung (blau). © AB Sciex

Bei dieser Form der High Resolution-MS sind so hohe Genauigkeiten bei der Massenbestimmung möglich, dass nur noch mit Fehlern im unteren ppm-Bereich zu rechnen ist (1 ppm entspricht bei 1000 Dalton einer Auflösung von 1 mDa). QTOF-Systeme mit langen Flugrohren und Reflektor-Technik erreichen Massenauflösungen von z.B. 50 000 FWHM (Full Width at Half Maximum) und können 50 Spektren (bzw. >30 im MS/MS) pro Sekunde aufnehmen.

Weniger verbreitet sind Varianten, wie FT-ICR-MS (wenige Speziallabore; extrem teuer; Kühlung mit flüssigem Helium für Magnet notwendig) und Sektorfeld-MS (primär für GC-HRMS z.B. in der Dioxinanalytik, etc.). Vom Prinzip ähnlich der FT-ICR-MS ist die Orbitrap-Technik (Bild 9, rechts unten), die ein elektrostatisches Feld statt eines Magnetfeldes nutzt (dzt. nur ein Hersteller) und daher auf die kostspielige He-Kühlung verzichten kann. Mittels Orbitrap sind bei einer Daten-Akquisitions-Rate von 1 Hz derzeit Auflösungen bis ca. 140 000 (bei 12 Hz ca. 17 500 FWHM) möglich. Beim sog. Unknown-Screening können daraus Summenformeln so präzise bestimmt werden, dass letztlich nur noch wenige Substanzen in Frage kommen.

Bild 9: Aufbau und Auflösungsvermögen eines modernen Tandem-MS mit Orbitrap-Technologie für die LC. Die Orbitrap als Herzstück des Systems ist im Detail unten rechts mit dem Oszillationsbereich eines Ions (grün) dargestellt. © Thermo Fisher Scientific

Tandem-Massenspektrometrie
Während die UV-Detektion in der HPLC meist relativ unselektiv ist, liefert der Diodenarray-Detektor (DAD) zu jedem Peak zumindest Spektralinformationen im UV-Vis-Bereich (Bild 6, oben rechts). Ein Massenspektrometer im Full-Scan-Modus stellt im Regelfall schon wesentlich mehr molekülspezifische Informationen zur Verfügung. Einen bestimmten Teil dieser MS-Fragmente noch einmal genauer zu analysieren, ermöglicht die Tandem-Massenspektrometrie. Darunter versteht man die Kopplung von zwei Massenanalysatoren über eine sog. Kollisionszelle, die meist von einem Quadrupol gebildet wird. Die ohnehin schon hohe MS-Selektivität wird bei der MS-MS-Kopplung noch einmal um eine weitere Dimension vergrößert. Sehr oft werden drei Quadrupole (Q) mit Nominalauflösung in Serie geschaltet. Geräte mit dieser weit verbreiteten Bauweise werden daher auch als Triple-Quadrupol bzw. QqQ bezeichnet und erzielen besonders hohe Nachweisempfindlichkeiten bei sehr guter Selektivität (Bild 6).

In der Tandem-MS (Bild 6, unten) wird ein diagnostisches Ion (z.B. die Molekularmasse, protoniert bzw. deprotoniert) als sog. Vorläufer-Ion (Precursor) in der Kollisionszelle fragmentiert und entweder das hochselektive Spektrum registriert (Produkt-Ionen-Scan) oder man beschränkt sich zugunsten der Empfindlichkeit auf ein oder zwei Produkt-Ionen (SRM oder MRM; Selected oder Multiple Reaction Monitoring; Bild 7).

Bild 10: Kombination der Ionenmobilitäts-Spektrometrie vor der Tandem-Massenspektrometrie (QTOF). © Agilent Technology

Bei geeigneter Wahl des Precursors ist es schon sehr unwahrscheinlich, dass eine Störsubstanz gleichzeitig chromatographisch eluiert und auch dasselbe Vorläuferion bilden kann. Dass dieser Interferenz-Precursor dann bei der Fragmentierung auch noch in die exakt gleichen Bruchstücke zerfällt, erscheint bei geeigneter Parameterwahl praktisch fast unmöglich zu sein.

Die Identifizierung mit sog. Hyphenated-Techniken gilt daher in der Analytik derzeit als äußerst sicher. Insbesondere wenn eine gute chromatographische Trennung mit der Tandem-Massenspektrometrie diametral unterschiedliche Separationstechniken verknüpft, werden die derzeit höchsten Selektivitäten erzielt. Diese sind oft ausreichend dafür, dass selbst in der Spurenanalytik auf ein aufwendiges und damit teures Clean up verzichtet werden kann („Dilute and Shoot“-Methoden). Das gilt besonders für die Tandem-Versionen, welche in der 2. Dimension eine hochauflösende MS verwenden (Q-TOF; Orbitrap; Bilder 8 und 9).

Bild 11: Alternative Anordnung der IMS inmitten des Tandem-Massenspektrometers (TOF mit 2-facher Reflexion). © Waters (Modell Synapt)

Querschnitt trifft Masse
Selbst die beste hochauflösende Massenspektrometrie (HRMS) reicht nicht aus, um isobare Verbindungen mit gleicher Summenformel zu trennen und zu identifizieren. Die Erweiterung um eine orthogonale Trenndimension mittels Ionenmobilität in der Gasphase (IMS in Bild 10 und 11) kann die Peakkapazität enorm steigern. Die zusätzliche Selektivität resultiert aus den unterschiedlichen Ionen-Transferzeiten im elektrischen Feld, denn sie sind nicht nur von der Ladung, sondern auch von der Größe und Form der Ionen abhängig.

Besonders mit langen Driftzellen (Drift tube in Bild 10 ca. 80 cm) lassen sich bei der eingangs erwähnten, klassischen IMS die Ionen nicht nur nach ihrem m/z-Verhältnis trennen, sondern durch die lange Driftzeit (IMS drift time) sogar klassifizieren. Durch experimentelle Messungen der Driftzeiten können Kollisionsquerschnitte (sog. Collision Cross Section, CCS) bestimmt werden. Die CCS korrelieren mit der Struktur und werden für Identifizierungszwecke bereits in Bibliotheken hinterlegt.

Eine enorme Steigerung der Gesamtselektivität wird zum Beispiel erreicht, wenn eine IMS mit langer Driftstrecke vor ein QTOF geschaltet wird (Bild 10). Das Precursor-Ion wird somit nicht nur vom Quadrupol des MS-MS auf eine bestimmte Masse eingestellt, sondern vorher schon durch die IMS-Driftzeit zusätzlich charakterisiert. Nach der Kollision im Tandem-MS werden alle Fragmente mit dem sehr schnellen TOF-Massenspektrometer in hoher Informationsdichte registriert.

Die Fragmentierung nach der IMS stellt die Information zur Verfügung, dass das Precursor-Ion und alle davon abgeleiteten Bruchstücke aus derselben Driftzeit stammen. Es ist auch eine Konfiguration möglich, bei der sich die IMS zwischen den beiden Massenanalysatortypen befindet (Bild 11).

Die Berechnung der Kollisionsquerschnitte (CCS) aus Ionenmobilitäts-Messungen erlaubt bei manchen Modellen die Bestimmung der Molekülgröße ohne Verwendung von Referenzsubstanzen oder Kalibrier-Tabel- len. Sie werden derzeit schon dazu verwendet, Polymere, Proteine, Peptide, Lipide, Biopharmazeutika, etc. zu charakterisieren. Dabei ist es oft notwendig, zwischen verschiedenen Formen von Isomeren und strukturähnlichen Molekülen und Komplexen zu differenzieren. Die Kombination der IMS mit der hochauflösenden Massenspektrometrie (QTOF) ist sogar in der Lage, nachzuweisen, ob ein Protein gefaltet, gestreckt oder fehlgebildet (z.B. fehlerhafte Disulfid-Brücken) ist.

Ob die Gesamtselektivität einer Analysenmethode für einen bestimmten Anwendungszweck (d.h. Analyt-Matrix-Kombination) ausreicht, muss letztlich bei der Methoden-Validierung für einen bestimmten Konzentrationsbereich bewiesen werden („fit for purpose“).

Wolfgang Brodacz, AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik

Autor:
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik
4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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