Methodenentwicklung in der organischen Spurenanalytik

Teil 1: Von der Probennahme bis zur Chromatographie

Die Entwicklung einer analytischen Methode ist geprägt vom Streben nach einem Begriff: Selektivität. Letztlich drehen sich alle Teilschritte um eine Maximierung der analytischen Selektivität. Das bedeutet, dass alle Zielanalyten vollständig erfasst und alles andere (Matrix, Störstoffe, etc.) so stark wie möglich diskriminiert werden soll.

Bild 1: Beispiel eines GC x GC 3D-Contour-Plots mit den beiden unterschiedlichen Phasenpolaritäten als x- und y-Achse sowie der farblich kodierten Signalintensität als z-Achse. © Shimadzu

Bei einer Mykotoxin-Tagung in Österreich hatte ich die herausfordernde Aufgabe, den letzten Vortrag zum Thema „Methodenentwicklung in der organischen Rückstandsanalytik“ zu halten. Viele Referate mit angeregten Diskussions-Beiträgen hatten Verspätungen angesammelt, die meiner gesamten vorgesehenen Redezeit entsprach. Somit war ich mit der Erwartungshaltung der Zuhörer konfrontiert, meinen Vortrag möglichst kurz zu halten, deshalb begann und schloss ich meinen Vortrag sinngemäß mit dem Statement: „Wenn ich meine Empfehlungen zur Methodenentwicklung in der verbleibenden Zeit auf ein Wort reduzieren müsste, dann käme nur ein Begriff dafür in Frage: „Selektivität!“

Unter Selektivität versteht man in der analytischen Chemie das Ausmaß der Fähigkeit einer Analysenmethode, den (die) Zielanalyten so gut wie möglich (untereinander und) von Begleitstoffen unterscheiden zu können, so dass sie sich gegenseitig möglichst nicht mehr stören oder beeinflussen. Im Unterschied dazu wird bei der sog. Spezifität davon ausgegangen, dass für einen Zielanalyten alle möglichen Störungen durch andere Komponenten zu 100 % ausgeschlossen werden können. Da dies in der Praxis aber nie vollständig erreicht werden kann, empfiehlt die IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry), diesen Begriff nicht mehr zu verwenden. Im Folgenden ist aus Platzgründen eine Beschränkung auf Aspekte der organischen Spurenanalytik notwendig.

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Ideal wäre es, schon bei der Probennahme einen Trennschritt zu implementieren, um sofort zu Beginn der Analyse alle unerwünschten Störstoffe außen vor zu lassen, oder sie zumindest gleich anschließend so schnell wie möglich auszusondern (Clean up). Wenn das alles nicht ausreichend gelingt, müssen sie bei der Chromatographie voneinander separiert werden oder beim letzten Schritt der Analytik, d.h. bei der Detektion, zumindest „unsichtbar“ bleiben. Bild 2 zeigt eine Übersicht der gebräuchlichsten Verfahren zur Gewinnung von Methoden-Selektivität. Im Regelfall nimmt der Selektivitätsgewinn nach unten hin zu.

Bild 2: Methodenschema mit den wichtigsten Techniken für die organische Spurenanalytik.

Probennahme und Extraktion
Die erste Gelegenheit, dem Streben nach Selektivität zu entsprechen, ist die Probennahme. Idealerweise wird schon von Beginn an nur der wirklich „interessante“ Teil der Gesamtprobe mitgenommen. Hier kann man sich unter anderem die Flüchtigkeit (auch die Partikelgröße kann eine große Rolle spielen) von Zielanalyten zunutze machen. Leichtflüchtige Schadstoffe aus der Luft können meist direkt auf Feststoffen (Tenax; Aktivkohle etc.) adsorbiert werden. Ebenso werden in der Wasseranalytik flüchtige Schadstoffe oft (bei erhöhter Temperatur) mit Gas aus dem Wasser ausgetrieben und selektiv adsorbiert (Purge and Trap). Die Desorption der Zielanalyten kann dann thermisch (Thermodesorption) oder mit Lösungsmitteln (Elution) erfolgen. Bei der Head-Space-Technik wird ebenfalls die Volatilität der Zielanalyten genutzt, denn man analysiert idealerweise nur noch den Dampfraum über der getesteten Flüssigkeit, ohne das Analysensystem mit Flüssigkeiten oder gar mit Feststoffen zu belasten.

Bei großen Polaritätsunterschieden zwischen Matrix (z.B. Wasser) und Zielanalyten (z.B. unpolare Schadstoffe) sollte die hohe Polarität des Wassers zu dessen Diskriminierung genutzt werden. Nur die unpolaren Schadstoffe reichern sich bei der Reversed Phase–Solid Phase Extraction (RP-SPE) an. Auf denselben Prinzipien beruhen die Solid Phase Micro Extraction (SPME) und die sehr innovative Stir Bar Sorptive Extraction (SBSE; Twister®).

Bei Feststoffen ist es ratsam, möglichst nur die Zielanalyten zu extrahieren. Eine Technik wie die Supercritical Fluid Extraction (SFE), bei der überkritisches CO2 als Extraktionsmittel verwendet wird, nutzt möglichst selektive Druck- und Temperatureinstellungen zur Steuerung der Selektivität der Extraktion. Reichen diese Steuerungsvariablen nicht aus, um die Analyten vollständig herauszulösen, müssen organische Modifier (Zugabe von Lösungsmitteln) eingesetzt werden. Bei der ASE (Accelerated Solvent Extraction) wird überhaupt auf das CO2 verzichtet und nur noch mit einem Lösungsmittel(gemisch) (quasi 100 % Modifier) unter Temperatur- und Druckunterstützung extrahiert. Je drastischer die Extraktionsbedingungen (d.h. Temperatur und Druck erhöht) sind, desto höher wird die Extraktionsausbeute ausfallen. Im Gegenzug geht damit aber oft die angestrebte Selektivität verloren und es werden zunehmend auch viele (polare) Störstoffe mitextrahiert.

Bild 3: Prinzip der LC x LC mit 2D-Contour-Plot. © Agilent Technologies

Clean up
Immer wenn die Probennahme und Extraktion wenig zur Selektivität beitragen kann, muss mit Hilfe des sog. Clean ups versucht werden, den Großteil der störenden und unter Umständen sogar geräteschädigenden Begleitstoffe abzutrennen. Die vielfältigen Clean-up-Verfahren nutzen allgemeine bis sehr spezifische Eigenschaften der Zielanalyten. Im ersten Fall sind sie zwar breiter einsetzbar, aber meist weniger effektiv wie z.B. die Flüssig/Flüssig-Verteilung oder die dispersive SPE (QuEChERS; Quick Easy Cheap Effective Rugged Safe). Im zweiten Fall kann mit z.B. IAC und MIP sehr hohe Selektivität gewonnen werden.

Es sollen hier nur die wichtigsten Reinigungsverfahren im Überblick (nach Selektivität ansteigend) mit dem Hauptmechanismus der Separation erwähnt werden:

  • LLE: Flüssig/Flüssig-Verteilung (Löslichkeit).
  • SPE: Solid Phase Extraction (Festphasenextraktion) (Adsorption).
  • SPME: Solid Phase Micro Extraction (Adsorption).
  • GPC: Gel-Permeations-Chromatographie (Größenausschluss).
  • SC: Säulenchromatographie (Adsorption).
  • IAC: Immuno-Affinitäts-Säulen (Struktur).
  • MIP: Molecularly Imprinted Polymer (Struktur).

Das Clean-up-Verfahren ist oft der aufwendigste Teil einer Analyse und damit ein wichtiger Kostenfaktor, zumal die Automatisierungsmöglichkeiten im Vergleich zu den folgenden Methodenstationen oft eingeschränkt sind.

GC-Injektion
Während man bei der Probenaufgabe in der GC mit verdampfendem Injektor bestrebt ist, den Hauptfehler dabei – die sog. Diskriminierung – zu vermeiden, kann gerade diese unter Umständen gezielt genutzt werden, um die Selektivität zu verbessern. Bei ausreichend großen Unterschieden in der Flüchtigkeit von Zielanalyten und unerwünschten Begleitstoffen kann über dieses Kriterium bewusst differenziert werden. Besonders PTV-Injektoren (Programmed Temperature Vaporizer) stellen eine Reihe von zeitlich variierbaren Parametern zur Verfügung, um Lösungsmittel und leichtflüchtigere Störstoffe regelrecht auszublenden und nur die schwerflüchtigen Zielanalyten auf die Trennsäule zu transferieren.

Die PTV-Temperatur wird während der Ausblendphase (bei offenem Split-Ausgang) so gewählt, dass das Lösungsmittel gerade gut genug verdampfen kann, während die Zielanalyten im Liner zurückbleiben. Als grober Richtwert können ca. 30 K unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels angenommen werden. Beim anschließenden schnellen Aufheizen bei geschlossenem Split startet der effektive Transfer der Zielanalyten in das chromatographische System.

Umgekehrt ist es ebenfalls möglich, die leichtflüchtige Fraktion sofort in die Kapillare und zum Detektor zu leiten, während unerwünschte Hochsieder (meist Verunreinigungen) durch Flussumkehrtechniken (Backflush) zum Injektor „zurückgeschickt“ und aus dem GC-System abgeleitet werden.

Chromatographie
Der Begriff Selektivität wird praktisch immer als erstes mit der chromatographischen Trennsäule in Verbindung gebracht. Das kommt nicht von ungefähr, denn bei der Chromatographie kann ein hohes Potenzial an Abtrennmöglichkeiten von Begleitstoffen gehoben werden. Informationen zur Auswahl von Phasen in der LC und GC und zur Optimierung der Trennungen füllen darauf spezialisierte Bücher. Der Versuch, dieses umfangreiche Thema auch nur halbwegs zu erläutern, würde den Rahmen dieses Artikels sprengen.

Zu den wichtigsten Kriterien in der GC zählen die Polaritäten von stationärer Phase und Zielanalyten, aber auch der Störstoffe, ebenso wie die Flüchtigkeit aller Analyten.

In der HPLC ist zusätzlich die Polarität und Elutionskraft des Eluenten(gemisches) von besonderer Bedeutung, während das Trägergas in der GC die Selektivität praktisch nicht beeinflusst.

Auf der Seite der stationären Phasen steht in der Flüssigkeitschromatographie alleine schon bei den weit verbreiteten C18-Reversed Phase-Materialien eine sehr große Auswahl an Varianten zur Verfügung. Eine Vielzahl von Laufmitteln und vor allem deren Mischungen können in Kombination damit enorm zur optimalen chromatographischen Selektivität beitragen.

In der GC ist die Phasenauswahl zwar nicht so vielfältig, es besteht aber eine sehr große Variabilität in der Gestaltung von mehrstufigen Temperaturprogrammen zur Steuerung der Trennungen. Die im Vergleich zur LC geringere Auswahl an Kombinationsmöglichkeiten von stationärer und mobiler Phase wird in der GC oft durch die wesentlich höhere Trennleistung der Kapillarsäulen wettgemacht. Die normale (d.h. eindimensionale) Chromatographie 1D-GC ist eines der wichtigsten und effizientesten analytischen Trennverfahren und trägt einen erheblichen Anteil zur Gesamtselektivität einer Analysenmethode bei.

2D-Chromatographie
Die ohnehin schon umfangreichen Möglichkeiten dieses Separationsverfahrens können durch Säulenschalt-Techniken im wahrsten Sinn des Wortes noch um eine Dimension erweitert werden. Wird ein Teil eines Chromatogramms „herausgeschnitten“ und auf eine zweite Säule mit unterschiedlicher stationärer Phase transferiert, so bezeichnet man diese Technik als Heart-cutting. Der technische Aufwand macht dann Sinn, wenn normalerweise unaufgelöste Peaks auf einer selektiveren Trennsäule in der zweiten Dimension separiert werden können. Die Prozedur kann im Idealfall für mehrere Elutionsbereiche der ersten Dimension wiederholt werden.

Auf die Spitze getrieben wird dieses Prinzip in der sog. multidimensionalen Chromatographie, die auch als umfassende Chromatographie bezeichnet wird und in der Gaschromatographie als Comprehensive Two-Dimensional GC (GC x GC) bekannt ist.

Dabei werden während der gesamten Analyse mittels eines thermischen Modulators (gekühlt/geheizt), mit einer festgelegten Frequenz wiederholt, sehr schmale Schnitte (z.B. 1...10 s) auf eine zweite Säule transferiert. Als erste Kapillare wird meist eine unpolare Säule (z.B. 30 m; 0,25 mm; 0,25 µm) eingesetzt, die an eine sehr kurze (ca. 1 m), polare Dünnfilmsäule (0,1 µm) übergibt. So wird jeder Peak auf zwei unterschiedlichen Phasenpolaritäten chromatographiert und graphisch dargestellt, entsteht ein mehrfarbiger sog. Contour-Plot (Bild 1).

Diese enorme Auftrennungsverbesserung ist technisch sehr aufwendig und nur möglich, wenn die Chromatographie in der zweiten Dimension schneller abläuft, als der Cut auf der ersten Säule dauert. D.h. ein 5-s-Schnitt auf der ersten Säule muss in <5 s aus der zweiten Dimension eluieren.

Neben der enorm verbesserten Auflösung hat die Comprehensive GC auch Vorteile beim Methoden-Detektionslimit (MDL). Das MDL wird bei der konventionellen GC (1D-GC) einerseits vom ständigen elektronischen Rauschen (GC-Detektor-Rauschen) und andererseits vom „chemischen“ oder „chromatographischen“ Rauschen bestimmt. Letzteres wird durch den Temperatureinfluss vom Säulenbluten und auch vom Lösungsmittel-Tailing verursacht. Das wiederum hat oft seinen Ursprung in den allseits verwendeten Graphit-Ferrules im Injektor. Bei der Injektion absorbieren sie das Lösungsmittel förmlich wie ein Schwamm und geben es langsam, aber nahezu kontinuierlich während des chromatographischen Laufes wieder ab. Das resultierende, langanhaltende LM-Tailing trägt mit dem Säulenbluten am stärksten zum Rauschen bei, so dass das rein elektronische Rauschen, das übrigens praktisch nicht reduziert werden kann, von untergeordneter Bedeutung ist.

Je geringer das Analyt-Signal wird und es sich dem Gesamtrauschen nähert, desto schwieriger wird es, den Analyt-Peak zu erkennen. Die Möglichkeit, die Analyten durch GC x GC untereinander und vom chromatographischen Rauschen abzutrennen, ist von enormer Bedeutung für die Steigung des MDL. In dem Maße wie die MDL bei der 1D-GC unmittelbar von nahe eluierenden Interferenzen oder vom chemischen Rauschen verschlechtert wird, in dem Ausmaß bringt eine GC x GC-Trennung die ersehnte Verbesserung der MDL. Bei einem direkten Vergleich der Sensitivität von GC x GC versus 1D-GC bei FID bzw. TOF-MS konnte im Durchschnitt eine MDL-Verbesserung um ca. eine Zehnerpotenz erzielt werden (Ahmed Mostafa, Tadeusz Górecki; „Sensitivity of Comprehensive Two-dimensional Gas Chromatography (GC x GC) Versus One-dimensional Gas Chromatography (1D GC)“; LCGC Europe Volume 26, Issue 12, pp. 672-679; Dec 2013). Gerade bei sehr komplexen Gemischen ist oft nur die GC x GC in der Lage, die Peaks basisliniengetrennt zu isolieren und damit eine signifikante S/N-Steigerung zu leisten.

Die Comprehensive-Technik wird mit speziellen Säulenschaltungen zwischen unterschiedlichen Phasenmaterialien auch schon in der HPLC angewendet. Bild 3 zeigt das Prinzip der „Comprehensive 2D-LC“ mit einem Contour-Plot und der Aufspaltung des 3.Peaks in zwei Komponenten.

Eine weitere Kopplungsvariante ist die Kombination von völlig unterschiedlichen (orthogonalen) Chromatographie-Techniken z.B. in der Form der LC-GC. Das eröffnet neue Möglichkeiten für hoch automatisierte Verfahren, welche die HPLC zur Vorreinigung benützt und die Zielanalyten über ein verdampfendes Interface (spezielle Varianten der „Large Volume On Column“-Injektionstechniken) der hohen Trennleistung von GC-Kapillarsäulen zuführt. Gerade die Differenzierungsmöglichkeiten der LC nach Polarität von Phase, Laufmittel und Analyten, kombiniert mit der Nutzung der GC-Trennung nach Flüchtigkeit, steigert die Gesamtselektivität bei der LC-GC enorm.

Teil 2 dieses Artikels finden Sie demnächst auch auf dieser Website und ist dem weiten Feld der Detektion gewidmet, die ein besonders hohes Potential an Selektivitätssteigerungen verspricht.

Wolfgang Brodacz, AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit

Autor:
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik
4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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