Fachbeitrag

Vergleich der Empfindlichkeit

von Fluoreszenz-Spektralphotometern
Hitachi F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer.

Dr. Uwe Binninger*)

  1. Uwe Binninger Analytik, Fasanenweg 10, D 73527 Schwäbisch Gmünd, Tel. 07171/4950620, Fax 07171/4950621, info@ub-analytik.de, http://www.ub-analytik.de
Um die Empfindlichkeit von Fluoreszenz-Spektralphotometern miteinander zu vergleichen, wird meist das Signal/Rausch-Verhältnis (S/N-Verhältnis) der Raman-Bande von Wasser herangezogen. Da es aber keine allgemeingültige Methode zur Ermittlung des S/N-Verhältnisses gibt, verwenden die verschiedenen Hersteller meist unterschiedliche Methoden zur Berechnung. Auch die Messparameter bei der Datenerfassung unterscheiden sich oft deutlich. Dies hat zur Folge, dass die spezifizierten S/N-Verhältnisse oft nicht direkt miteinander vergleichbar sind.

Im Folgenden soll aufgezeigt werden, worauf beim Vergleich der Zahlenwerte zu achten ist und wie sie zu bewerten sind, bzw. wie sie zumindest in etwa vergleichbar gemacht werden können. Welche Parameter beeinflussen nun auf welche Weise das S/N-Verhältnisses?

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Am offensichtlichsten ist zunächst die verwendete Spaltbreite: Je breiter die Excitations- und Emissions-Spalte eingestellt werden, umso mehr Lichtenergie kann zum Detektor, dem Photomultiplier (PMT) gelangen. Hieraus resultiert natürlich ein höheres Signal, der Dunkelstrom des PMT und das Rauschen von Lampenintensität und Elektronik bleiben aber unverändert. Mit einer Verdoppelung der Spaltbreite, von z.B. von 5 auf 10 nm, wird auch das S/N-Verhältnis etwa um den Faktor 2 je Spalt größer. Daher gibt inzwischen jeder Hersteller bei seinen Gerätespezifikationen die bei der Ermittlung verwendete Spaltbreite an.

Weit weniger offensichtlich ist jedoch der Einfluss der Methode zur Bestimmung des Rauschens. Gerade diese hat aber den größten Einfluss auf den Zahlenwert des S/N-Verhältnisses. Wichtig sind hierbei zum einen das Wie, d.h. der verwendete mathematische Algorithmus, und zum anderen das Wo, also an welcher Stelle des Spektrums.

Zunächst zum Wie. Hier werden prinzipiell zwei verschiedene Methoden angewandt:

1. Die Peak zu Peak-Methode und

2. die Root Mean Square-Methode (RMS).

Bei Ersterer wird direkt der Mittelwert der Differenzen zwischen Maximum und Minimum innerhalb definierter Intervalle eines Zeit-Scans gebildet [N = (N1 + N2 +…Nn)/n]. Bei der zweiten Methode, oft auch quadratisches Mittel genannt, wird aus den Differenzen innerhalb der Intervalle der Mittelwert der Quadrate gebildet und daraus die Wurzel gezogen [N = ((x12 + x22 +…xn2)n)½]. Auf diese Weise ergibt sich ein deutlich niedrigerer Wert für das Rauschen als bei der Peak-zu-Peak-Methode und somit ein höherer Wert für das Signal/Rausch-Verhältnis.

Nun zum Wo. Auch hier gibt es wieder zwei Möglichkeiten:

1. Am Maximum des Raman-Peaks,

2. am Untergrund, also praktisch im Dunkeln.

Während die erste Methode sämtliche Rauschquellen des Systems erfasst (Lampe, Photomultiplier, Elektronik, eventuelle Schwebstoffe im Wasser), beeinflussen bei der zweiten Methode nur die Auswerteelektronik und der Dunkelstrom des PMT das Ergebnis. Der Wert des Rauschens am Peak-Maximum ist somit erwartungsgemäß um ein Vielfaches höher als bei der Untergrundmessung, typischerweise um Faktor 5 bis 7.

Die meisten Hersteller, wie auch Hitachi, verarbeiten das analoge Signal des Photomultipliers. Sie setzen dann auch überwiegend die RMS-Methode ein und messen das Rauschen meist am Peak-Maximum. Einige Hersteller jedoch bieten sogenannte Photon-Counting-Geräte an. Dabei werden die Impulse gezählt, die durch die am PMT auftreffenden Photonen ausgelöst werden. Sie bestimmen das Rauschen am Untergrund, z.B. bei 450 nm und nicht am Raman-Maximum von 398 nm (bei 350 nm Excitations-Wellenlänge). Das hieraus resultierende S/N-Verhältnis ist dann natürlich entsprechend höher und verspricht eine höhere Empfindlichkeit. Aber ist dem wirklich so?

Hitachi spezifiziert für das F-7000 Fluoreszenz-Spektralphotometer eine Empfindlichkeit von S/N >800 an (RMS, 5 nm Spaltbreiten, 2 s Response, N am Peak-Maximum bestimmt). Für ein bekanntes Photon-Counting-Gerät gibt der Hersteller einen Wert von 3000:1 für S/N an (5 nm Spaltbreiten, S bei 397 nm und N bei 450 nm Emissionswellenlänge ermittelt). Vergleicht man die reinen Zahlenwerte, sollte das Photon-Counting-Gerät demnach also um Faktor 3,75 empfindlicher sein.

Um zu zeigen, dass in Wirklichkeit das Hitachi F-7000 das empfindlichere Fluorometer ist, wurde das Signal/Rauschverhältnis des F-7000 mit den vom Wettbewerber angegebenen Parametern berechnet: S/N = (Signalintensität des Raman-Peaks von Wasser bei 398 nm – Intensität des Untergrundes bei 450 nm)/Rauschen bei 450 nm.

Für die Messungen wurden weiterhin folgende Parameter verwendet: Excitations-WL: 350 nm, Spaltbreiten: 5 nm EX und EM, Datenintervall Zeit-Scan: 0,5 s, Response: 2,0 s.

Das Ergebnis entsprach voll und ganz den Erwartungen. Im Einzelnen ergaben sich folgende Messwerte: I(398) = 262,1, I(450) = 4,9, N(450) = 0,045. Hieraus berechnet sich entsprechend ein Signal/Rausch-Verhältnis von S/N = (262,1 – 4,9)/0,045 = 5715. Mit der von Hitachi angewandten Methode ergab sich aus dem gleichen Spektrum ein Wert von nur 836, da N(398) = 0,31 war, also ein Unterschied von etwa Faktor 6,8.

Dieses Beispiel zeigt also deutlich, dass beim Vergleich der Empfindlichkeiten unterschiedlicher Geräte sehr genau auf die Messparameter und die Berechnungsmethode geachtet werden muss. Nur die Verwendung der gleichen Methode erlaubt auch einen exakten Vergleich der Empfindlichkeitswerte. Letztendlich aussagekräftiger als das Signal/Rausch-Verhältnis der Raman-Bande des Wassers ist die Angabe einer Nachweisgrenze für ein stabiles und gängiges Fluorophor, wie z.B. das Fluorescein, natürlich unter Angabe der Definition der Nachweisgrenze.

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