Triple Quadrupol-Massenspektrometer sind derzeit die Arbeitspferde der organischen Spuren­analytik und der Goldstandard für hochsensitive Quantifizierungen. Der schnell wachsende Bedarf, immer mehr Zielanalyten in den Untersuchungsumfang zu integrieren, stellt neue Anforderungen an die Massenspektrometrie. Die zunehmend leistungsfähigeren High Resolution-Systeme in Hybridbauweise sind bestens gerüstet, diese Aufgaben zu erfüllen. Kann die Hochauflösung die klassischen Triple Quads verdrängen und wo liegen die jeweiligen Stärken?

Bild 2: Information Dependent Acquisition (in Abhängigkeit vom Survey Scan wird ein Full Scan als sog. Dependent Scan getriggert). © AB Sciex (modifiziert W. Brodacz)

Im Bereich der niederauflösenden Tandem-MS wird die IDA schon längere Zeit z. B. mit den Möglichkeiten der als QTRAP bezeichneten linearen Ionenfalle (LIT) genutzt. Das Gerät ist wie ein konventionelles Triple Quadrupole-Massenspektrometer aufgebaut, allerdings kann der letzte Quadrupol (Q3) auch als lineare Ionenfalle mit dynamischer Füllzeit betrieben werden. Dadurch besteht die Möglichkeit, dass während der Füllung der LIT der Ausgang verschlossen („Trapping“) und nur beim „Scanning“ geöffnet wird. Damit lassen sich höhere Empfindlichkeiten bei der Aufnahme von Produktionen-Spektren („Enhanced Product Ion“ EPI) erzielen, welche der automatisierten Absicherung und Identifizierung zugutekommen. Bei solchen Multitarget-Analysen mit Absicherungsbedarf wird ein rascher Wechsel zwischen klassischem MRM und EPI-Scan angestrebt. Getriggert wird dieses Umschalten durch die Funktion „Informa­tion Dependent Acquisition“. Ein IDA-Experiment vollzieht sich in den zwei Schritten: „Survey Scan“ und „Dependent Scan“. Taucht ein im Survey Scan programmierter MRM-Ionenübergang über einem Benutzer-definierten Threshold auf, so schaltet IDA das Massenspektrometer in den EPI-Scanmodus (Dependent Scan) um. Anschließend werden sofort wieder MRMs aufgezeichnet, um die Quantifizierung nicht zu beeinträchtigen. Darüber hinaus bietet die Software-Funktion „Dynamic Exclusion“ die Möglichkeit, bestimmte Ionen oder Ionenübergänge automatisch für eine bestimmte Zeit oder auch generell auszuschließen. Das kann sinnvoll sein, um auch Zielanalyten mit einer schwachen Intensität neben coeluierenden, starken Störsignalen detektieren zu können (Bild 2).

Die lineare Ionenfalle in der Triple Quad-äquivalenten Konfiguration QqLIT eröffnet mit einer zweiten Fragmentierung in der LIT als einziges Tandem-MS die Erweiterung um eine zusätzliche MS-Dimension (sog. MRM³ bzw. MS³). Bei bestimmten Applikationen kann damit die Selek­tivität noch einmal gesteigert und durch die Reduktion des Untergrundes über das höhere Signal/Rausch-Verhältnis auch die Nachweisempfindlichkeit verbessert werden. Diese dritte MS-Stufe ist mit hochauflösenden Tandemsys­temen nicht realisierbar, bei QqLIT aber auf die gerichtete Target-Analytik beschränkt.

High Resolution und Mass Extraction Window

Auf dem Gebiet der hochauflösenden Massenspektrometer haben schon seit einiger Zeit die Time of Flight-Systeme (TOF) eine dominierende Rolle eingenommen, wobei ein eindeutiger Trend zu höheren Auflösungen mittels Reflektor-Technik zu erkennen ist. Die ersten TOF-Geräte bestachen zwar mit einem bis dahin kaum bekannten massenspektrometrischen Auflösungsvermögen und den sehr hohen Datenraten, waren aber wegen der unzureichenden Sensitivität und Linearität für Quantifizierungen nur eingeschränkt verwendbar. Diese anfänglichen Limitierungen konnten aber rasch überwunden werden, und die Empfindlichkeit wurde stetig verbessert. Aktuelle Systeme reichen hinsichtlich der Sensitivität und des dynamischen Bereiches zwar langsam an die Triple Quadrupol-Systeme heran, können aber nur mit Modellen der vorletzten Generation gleichziehen.

Der hart umkämpfte Wettlauf um die beste Nachweisstärke ist natürlich auch an den neuesten Triple Quads nicht spurlos vorbeigegangen. Ganz im Gegenteil, die Innovationen zur Steigerung der Ionisationsausbeute und insbesondere der verbesserten Ionentransmission sind bisher immer von den neuesten QQQ-Systemen ausgegangen. Als „Working Horses“ der Quantifizierung stellen sie noch immer die Spitze der Sensitivitätspyramide dar.

Bild 3: Die Einengung des Mass Extraction Window steigert die Selektivität durch die Reduktion des Untergrundes und verbessert damit das Signal/Rausch-Verhältnis (in rot; links; von oben nach unten). © AB Sciex (modifiziert v. W. Brodacz)

Gewinne bei der Nachweisempfindlichkeit im Sinne von Verbesserungen der Signal/Rausch-Verhältnisse können auch durch höhere Selektivität erzielt werden. Und diese profitiert in der MS wiederum von der Hochauflösung mit guter Massengenauigkeit in Form eines eng gesetzten „Mass Extraction Window“ (MEW). Das MEW definiert als Darstellungsparameter der Auswertesoftware die Grenzen des Massenbereiches, welcher aus den hochaufgelösten Rohdaten extrahiert wird. Die Selektivität steigt, je schmäler das Mass Extraction Window gesetzt werden kann. Bild 3 verdeutlicht in der Einblendung rechts den enormen Auflösungsunterschied zwischen Triple Quads (QQQ; blau) und Hochauflösung (QqTOF; rosa). Der mit XIC (eXtracted Ion Chromatogram) bezeichnete Bereich markiert die Grenzen des MEW. Links sind drei Ionenchromatogramme dargestellt, die aus den QqTOF-Rohdaten einer Futtermittelprobe extrahiert wurden. Das Target-Ion für das Fungizid Carbendazim wurde mit drei verschiedenen, jeweils auf ein Zehntel reduzierten MEW vergleichend dargestellt. Durch die MEW-Einschränkungen wird Selektivität gewonnen und das Rauschen diskriminiert. Der reduzierte Untergrund steigert das Signal/Rausch-Verhältnis und damit die Sensitivität der Methode.

Entscheidungshilfen - keine Pauschalempfehlungen

In Anbetracht der hochentwickelten Techniken Tandem-MS mit Triple Quads und der Hybrid-Massenspektrometrie mit Hochauflösung stellt sich für Einsteiger oft die Frage: „Was ist besser?“ Abgesehen von der grundsätzlich falschen Fragestellung könnte sie ohne ausführliche Einschränkungen auch nicht beantwortet werden.

In verschiedenen Studien wurde versucht, die Selektivität der HRMS (oft auch nur in der Singlestage-Konfiguration) mit jener von niederauflösenden Tandem-Massenspektrometern zu vergleichen, [1] – [5]. Lehotay und Mol haben zu dieser Fragestellung gut fundierte Vergleiche gezogen und damit Entscheidungshilfen (keine Pauschalantworten) gegeben [6].

Zu den Selektivitätsverhältnissen zwischen der hochauflösenden Massenspektrometrie und der Triple Quadrupol-Technik wurde Folgendes festgestellt: Die erzielbare Selektivität der Hochauflösung kommt in erster Linie vom sog. Massenextraktionsfenster (Mass-Extraction Windows MEW), welches wiederum sehr stark von der technisch möglichen Auflösung abhängt. Für übliche Lebensmittel-Applikationen soll ein Auflösungsvermögen von ca. 50 000 (FWHM) mit einem MEW von +/- 5 ppm nötig sein, was mit jener Selektivität gleichgesetzt wird, die auch mit einem SRM-Übergang (Selected Reaction Monitoring) eines klassischen Triple Quads erreicht wird [7].

Aus den Arbeiten von Berendsen et al. ([8], [9]), sowie Hernández [10] zum Vergleich erzielbarer Selektivitäten verschiedener MS-Techniken, kann vereinfacht folgender Schluss gezogen werden: Die Single Stage-HRMS (Resolution z. B. 50 000) kann auch mit zwei hochaufgelösten Ionenspuren nicht jene Selektivität erreichen, welche von der Unit Resolution eines Triple Quad-Tandemmassenspektrometers mit nur zwei Fragment-Ionen erzielt wird. Genau diese QQQ-Konfiguration entspricht deshalb der derzeitigen, klassischen State-of-the-Art Target-Analytik.

Kaufmann [11] kommt beim Vergleich zwischen HRMS und Tandem-MS (QQQ) zur Ansicht, dass MS/MS bessere Bestimmungsgrenzen ermöglicht, wenn weniger als 100 Analyten gemessen werden müssen. Im Gegensatz zur durchschnittlichen Kollisionsenergie, wie sie manchmal bei der HRMS verwendet wird, führen die praktisch immer optimierten und analytspezifischen Kollisionsenergien in Triple Quads gerade bei sehr niedrigen Gehalten auch zu besseren Identifizierungsleistungen der Tandem-MS.

Im Hinblick auf erzielbare Identifizierungspunkte (IP nach 2002/657/EC European Commission Decision) stellt Hernández [10] bei einem Vergleich fest, dass mittels Q-TOF bis zu 20 IPs in einem Lauf erreichbar sind, dafür aber relativ hohe Analytkonzentrationen notwendig sind. QQQ-Systeme hingegen schaffen schon bei sehr geringen Konzentrationen zumindest 4 – 5 Identifizierungspunkte, welche nach dieser EU-Regulierung praktisch immer ausreichend sind. Bei Q-TOF besteht wiederum die Möglichkeit, zusätzlich auch Non-Target-Kontaminanten (bei entsprechend hoher Konzentration) zu entdecken.

Müssen überlappend eluierende Analyten simultan im positiven und negativen Modus in einem Lauf analysiert werden, eignen sich die Triple Quad-Geräte wegen der wesentlich kürzeren Polarity Switching-Zeiten (meist unter 50 ms) besser als die HR-Techniken.

Fit for Purpose

Für MS-Einsteiger und für einfache massenspektrometrische Applikationen sind Single Quad-Geräte meist wesentlich besser geeignet, als Methoden mit klassischen Detektoren. Die Herausforderung in der LC-MS steckt aber primär in der Schnittstelle, d. h. der Ionenquelle. Die Auswahl des geeigneten Ionenquellen-Typs und besonders dessen optimale Einstellungen entscheiden für den Unerfahrenen schnell über Erfolg, Frust oder Niederlage. Die Frage „Was soll ich kaufen, ein Triple Quad oder ein Hybridgerät mit Hochauflösung?“ sollte man nur dann mit dem (zugegebenermaßen sehr Hersteller-freundlichen) Rat „Beide“ beantworten, wenn hochsensitive Quantifizierungen und gleichzeitig anspruchsvolle Non Target-Aufgaben routinemäßig zu bewerkstelligen sind. Bei Aufgabenstellungen, die dazwischen liegen, muss aus Kostengründen wohl ein Kompromiss gefunden werden.

Bild 4: Schematische Strukturierung von Aufgabenstellungen, deren Voraussetzungen und der dafür geeigneten Techniken (grobe Schätzung). © W. Brodacz

Es ist auch nicht die Frage entscheidend, welche Technik selektiver ist, sondern welche für die exakte Fragestellung als „Fit for Purpose“ gelten darf, denn dafür sind Faktoren wie die Art und Anzahl der Analyten, die Matrix und deren Variationen, die Konzentrationen, Screening- und/oder Identifizierungs-Anforderungen etc. zu berücksichtigen. Letztlich kann diese Fragen, neben einer umfangreichen Erfahrung mit diesen Faktoren, nur die Validierung und Verifizierung auf falsch-negative und falsch-positive Ergebnisse exakt beantworten. Die konkrete Eignung eines Systems kann vor einer Anschaffung in der Praxis nur mit Testmessungen unter möglichst realistischen Rahmenbedingungen bei den Herstellern abgeschätzt werden.

Als grobe Richtlinie darf Folgendes angenommen werden:

• Triple Quadrupol-Systeme sind noch immer der Goldstandard bei der Quantifizierung in der Target-Analytik von z. B. Lebensmittel-Kontaminanten. Derzeit erreichen Sie im MRM-Modus noch immer die höchste Sensitivität und mit zwei Übergängen ausreichend gute Selektivität. Der meist auch größere dynamische Bereich unterstützt die Zielgruppe der Quantifizierer.
• Klassische Non Target-Aufgaben sind die Domäne von Hybrid-Systemen mit Hochauflösung (Q-HRMS wie Q-TOF etc.), insbesondere, wenn retrospektives Data-Mining erforderlich ist. Meist hat nicht die höchste Sensitivität die oberste Priorität, sondern die Fähigkeit, Unbekanntes möglichst sicher aufzuspüren (Unknown Screening).

Die erste und wichtigste Fragestellung muss daher lauten: „Was ist das konkrete Applikationsziel?“ Bei kombinierten Aufgabenstellungen von Unknown Screenings und Target-Quantifizierungen mit sehr vielen Zielanalyten, aber gemäßigten Empfindlichkeitsanforderungen, ist es möglich und oft auch sinnvoll, beides mit einem aktuellen Q-HRMS zu bewältigen (Bild 4).

Jedenfalls ist die Tragweite einer Fehlentscheidung beim MS-Typus größer als jene bei der Wahl des Herstellers desselben Typs.

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für
Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit –
Kontaminantenanalytik Linz
[email protected]

Literatur:

[1] S. Borras, A. Kaufmann, R. Companyo, “Correlation of precursor and product ions in single-stage high resolution mass spectrometry. A tool for detecting diagnostic ions and improving the precursor elemental composition elucidation”, Anal. Chim. Acta 772 ; 47–58; 2013

[2] A. Kaufmann, P. Butcher, K. Maden, S. Walker, M. Widmer, “Comprehensive comparison of liquid chromatography selectivity as provided by two types of liquid chromatography detectors (high resolution mass spectrometry and tandem mass spectrometry): Where is the crossover point?”, Anal. Chim. Acta 673; 60–72; 2010

[3] A. Kaufmann, S. Walker, “Post-run target screening strategy for ultra high performance liquid chromatography coupled to Orbitrap based veterinary drug residue analysis in animal urine”, J. Chromatogr. A 1292; 104–110; 2013

[4] A. Kaufmann, S. Walker, “Evaluation of the interrelationship between mass resolving power and mass error tolerances for targeted bioanalysis using liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry”, Rap. Comm. Mass Spectrom. 27; 347–356; 2013

[5] L. Vanhaecke, L. Van Meulebroek, N. De Clercq, J. Vanden Bussche, “High resolution Orbitrap mass spectrometry in comparison with tandem mass spectrometry for confirmation of anabolic steroids in meat”, Anal. Chim. Acta 767; 118–127; 2013

[6] Steven J. Lehotay, Yelena Sapozhnikova, Hans G.J. Mol, „Current issues involving screening and identification of chemical contaminants in foods by mass spectrometry“, Trends in Analytical Chemistry, Volume 69, Pages 62–75, June 2015

[7] M.M. Gomez-Ramos, C. Ferrer, O. Malato, A. Aguera, A.R. Fernandez-Alba, “Liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry for pesticide residue analysis in fruit and vegetables: screening and quantitative studies”, J. Chromatogr. A 1287; 24–37; 2013

[8] B.J. Berendsen, L.A. Stolker, M.W. Nielen, “The (un)certainty of selectivity in liquid chromatography tandem mass spectrometry”, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 24; 154–163; 2013

[9] B.J. Berendsen, R.S.Wegh, T. Meijer, M.W. Nielen, “The assessment of selectivity in different quadrupole-Orbitrap mass spectrometry acquisition modes”, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 26; 337–346; 2015

[10] Hernández, F., Ibáñez, M., Sancho, J.V., Pozo, Ó.J.; “Comparison of different mass spectrometric techniques combined with liquid chromatography for confirmation of pesticides in environmental water based on the use of identification points”. Anal. Chem. 76(15), 4349–4357, 2004

[11] A. Kaufmann, P. Butcher, K. Maden, S. Walker, M. Widmer, “Quantitative and confirmative performance of liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry compared to tandem mass spectrometry”, Rap. Comm. Mass Spectrom. 25; 979–992; 2011