Nicht-invasiv überwacht

Insektenzellkultur in orbital geschüttelten Kolben mit Sensoren

Ein Schüttelkolben-Reader leistet mit seinen nicht-invasiven optischen Sensoren für pH und DO einen Beitrag zur einfachen Quantifizierung des Sauerstoff-Massentransfers in Erlenmeyerkolben.

Bild 1: Versuchsaufbau zur Bestimmung der kLa-Werte. (A) Ausgasen mit NL mittels eines Silikonschlauchs, der durch ein Loch in der Belüftungskappe (B) eingeführt wurde. Nach dem Spülen mit N2 wurde der Silikonschlauch (C) herausgezogen, um den Kopfraum durch Luft zu ersetzen. © Bild: Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften

Auf Insektenzellen basierende Prozesse haben in den letzten Jahren bei der Werkzeugprotein- und VLP (Virus-like Particle)-Impfstoffproduktion zunehmend an Einfluss gewonnen. In kleinem Maßstab werden Insektenzellen normalerweise in nicht-instrumentierten, orbital geschüttelten Einwegkolben, in den meisten Fällen Erlenmeyerkolben, gezüchtet, um Seed-Train-Produktionen und frühe Verfahrensentwicklungsprozesse durchzuführen. Der Schüttelkolben-Reader „Shake Flask Reader“ von Presens leistet mit seinen nicht-invasiven optischen Sensoren für pH und DO (gelösten Sauerstoff) einen Beitrag zur einfachen Quantifizierung des Sauerstoff-Massentransfers in Erlenmeyerkolben. Zusätzlich erlaubt er eine kontrollierte Prozessdurchführung im Milliliter-Maßstab, wie es hier für die beschriebene Sf-9- und Sf-21-Zellmassenpropagierung beispielhaft dargestellt ist.

Insektenzellen und ihre Eigenschaften

Seit den frühen 1970er Jahren wurde die Eignung von Insektenzellen (in Verbindung mit dem Baculovirus Expression Vector System, BEVS) zur Herstellung komplexer Proteine in zahlreichen Artikeln und Reviews beschrieben. Diese Proteine wurden anschließend in Strukturanalysen, funktionellen Studien und bei der Herstellung von Diagnostika und Impfstoffen verwendet. Die eingesetzten Produktionszelllinien (Sf-9, Sf-21 und BTI-TN-5B1-4, auch bekannt als High Five™ oder Trichoplusia ni-Zelllinie) stammen von Spodoptera frugiperda und der Aschgrauen Höckereule (Trichoplusia ni). Selbst im Batch-Modus, bei Temperaturen zwischen 27 °C und 28 °C und einem pH-Wert zwischen 6,2 und 6,9, wachsen diese Zellen zu hohen Zelldichten (> 1 × 107Zellen/ml) heran. Voraussetzung dafür ist, dass ein optimiertes, serumfreies Kulturmedium vorhanden ist, das das Zellwachstum unterstützt, sowie geeignete Kultivierungssysteme, die Schäden durch Scherkräfte verhindern und eine ausreichende Sauerstoffversorgung gewährleisten. Der Parameter, der den Sauerstofftransfer in einem Kultivierungssystem charakterisiert, ist der kLa-Wert (auch bekannt als Sauerstofftransferkoeffizient).

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Bestimmung der kLa-Werte

Zur Bestimmung der kLa-Werte der Schüttelkolben von Presens (250 ml Gesamtvolumen, Standardbelüftungskappen) wurden diese mit dem Presens SFR ausgelesen. Die SFR-Einheit, die in einem Schüttelinkubator Ecotron (25 mm Schütteldurchmesser; Infors) montiert war, verfügt über neun optische Doppelmodule, die eine kabellose Echtzeitüberwachung und Anzeige von pH- und Sauerstoffwerten ermöglichen. Unter Verwendung der bekannten Standard-Ausgasungsmethode (s. Bild 1) wurden neun verschiedene Experimente (statistisch mit STAVEX 5.0-Software entworfen) bei variierenden Füllvolumina (zwischen 25 und 150 ml) sowie Schüttelfrequenzen (zwischen 80 und 200 U/min) durchgeführt. Alle Kolben liefen mit Sf-900 III SFM von Gibco Invitrogen bei einer Temperatur von 27 °C. DO-Konzentrationen wurden über die Zeit aufgezeichnet; experimentell sowie über STAVEX 5.0-Modell abgeleitete kLa-Werte wurden berechnet, wie es bei Ries et al. [1] im Detail beschrieben ist.

Bild 2: Experimentelle und Modell-abgeleitete kLa-Werte in untersuchten Presens-Kolben. Jede Zeile mit Zahlen von 20 bis 150 entspricht einem konstanten Füllstand in Milliliter. © Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften

Bei ausgewählten Kultivierungsparametern lagen die experimentellen kLa-Werte zwischen 4,4 und 37,9 pro Stunde; diese Werte stimmen gut mit den im Modell ermittelten Sauerstofftransferdaten überein (Bild 2).

Sauerstofftransferstudien während der Massenpropagation

Die Massenvermehrungen von Sf-9- und Sf-21-Zellen wurden in 250 ml-Schüttelkolben durchgeführt, die mit integrierten und vorkalibrierten pH- und DO-Sensoren von Presens ausgestattet waren. Sie dauerten zwischen sieben und acht Tage, wobei die Kolben mit 100 ml Sf-900 III SFM gefüllt, mit 5 × 10Zellen ml-1 inokuliert und bei 27 °C und 110 U/min inkubiert wurden. Unter diesen Bedingungen kann ein Sauerstofftransferkoeffizient von 5,6 pro Stunde angenommen werden. 

Die Probenahme erfolgte auf zwei verschiedene Arten. In Versuchsreihe 1 (Sf-9-Zellmassenvermehrung) wurde an jedem Kultivierungstag eine Probe aus allen Kolben entnommen, während in Versuchsreihe 2 (Sf-21-Zellmassenvermehrung) pro Tag nur eine Probe aus einem Kolben entnommen wurde. Die Probenanalysen umfassten Messungen der Lebendzelldichte und -lebensfähigkeit (mit Nucleocounter von Chemometec und Cedex Hires von Innovatis) und Offline-Bestimmungen von pH, Glucose, Lactat, Ammonium, Glutamin und Glutamat (mit Bioprofile 100 von Nova Biomedical).

Bild 3: (A) Wachstumskurve von Sf-9-Suspensionszellen in 250 ml-Presens-Kolben (Versuchsreihe 1). (B) Entsprechender DO-Verlauf. © Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften

Bild 3 zeigt einen DO-Verlauf aus Versuchsreihe 1, der durch Probennahme bzw. Öffnen des sterilen Verschlusses beeinflusst wurde, wobei am sechsten Tag der Kultivierung eine maximale Lebendzelldichte von 1,6 x 10Zellen/ml erreicht war. Es kann jedoch keine klare Aussage zu möglichen Massentransferbeschränkungen getroffen werden. Aus Ergebnissen der Versuchsreihe 2, in denen ein nicht beeinflusster DO-Verlauf garantiert werden konnte, ist offensichtlich, dass das Zellwachstum von Sf-21-Suspensionszellen bei Sauerstoffsättigung unter 10 % endete [1]. Aufgrund der Tatsache, dass diese Beobachtung mit denen anderer Gruppen übereinstimmt und Wachstumsinhibition aufgrund des Kulturmediums unserer Erfahrung nach unwahrscheinlich war, nehmen wir an, dass es am fünften Kultivierungstag zu einer Sauerstofflimitierung kam. Interessanterweise ist dies die Zeit unmittelbar vor Erreichen der maximalen Lebendzelldichte, die wiederum 1,6 × 107 Zellen / ml betrug. Die online pH-Daten entsprachen in beiden Versuchsreihen gut denen von offline gemessenen Proben.

Referenz:
[1] Ries C, John G, John C, Eibl R, Eibl D (2010): A shaken disposable bioreactor system for controlled insect cell cultivations at millilitre-scale, Life Science Engineering Vol. 10 (1), pp. 75 – 79

AUTOREN

N. Riesen, C. Ries, R. Eibl, D. Eibl 

Züricher Hochschule für Angewandte Wissenschaften, Life Science und Facility Management, Institut für Biotechnologie, Bioverfahrens- und Zellkulturtechnik, Wädenswil, Schweiz

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