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Mit bildgebender Massenspektrometrie und multivariater Statistik

Spektrometrische Pollenkornanalyse

Mit einer neuen, zuverlässigen Methode zur Pollenbestimmung können einzelne Pollen verschiedener Spezies, aber auch einzelne Pollenkörner in Mischungen erkannt und identifiziert werden.

Auch heutzutage erfolgt die Identifizierung der Pollenkörner meist durch aufwändige mikroskopische Bestimmung ihrer äußeren Erscheinung, obwohl in den letzten Jahren mehrere spektroskopische und spektrometrische Ansätze beschrieben wurden. © © Shutterstock/Mark Bridger

Blütenstaub stellt eine der Hauptursachen für allergische Erkrankungen des Menschen dar. Auch heutzutage erfolgt die Identifizierung der Pollenkörner meist durch aufwändige mikroskopische Bestimmung ihrer äußeren Erscheinung, obwohl in den letzten Jahren mehrere spektroskopische und spektrometrische Ansätze beschrieben wurden [1 – 3].

Eine dieser Methoden ist die Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation-Flugzeit-Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS). Die Unterscheidung verschiedener Pollenarten erfolgt dabei über die Analyse charakteristischer Peakmuster, denn Pollenkörner enthalten, wie jede andere biologische Probe, Proteine, Peptide, Lipide und Kohlenhydrate. Dazu ist es nicht unbedingt notwendig, die Struktur der detektierten chemischen Verbindungen, die diese MS-Signale repräsentieren, zu kennen. Sehr häufig sind die Unterschiede in den Spektren ähnlicher Probenarten sehr gering und mit bloßem Auge nicht erkennbar. Deshalb werden zur Differenzierung der spektralen Muster multivariate statistische Verfahren und insbesondere die Hauptkomponentenanalyse verwendet. Diese hebt Unterschiede (Varianzen) in einem gemessenen Datensatz hervor und ermöglicht eine varianzgewichtete Darstellung und verbesserte Klassifizierung.

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Herausforderung: Diskriminierung einzelner MS-Peaks

Neben der individuellen Charakterisierung einzelner Pollenkörner lag in der massenspektrometrischen Analyse von reellen Pollenkornmischungen eine weitere Herausforderung, da es in Mischungen sehr häufig zur Diskriminierung einzelner, möglicherweise charakteristischer MS-Peaks kommen kann. Hier wurde die bildgebende MALDI-TOF-Massenspektrometrie (engl. MALDI MS Imaging) angewendet, die lateral aufgelöste Spektren in einer gewählten Pixelgröße liefert. Diese Technik wurde erstmals von Caprioli beschrieben [4] und wird, außer in rein medizinischen Untersuchungen (z. B. Verteilung von Metaboliten oder Tumormarkern im Gewebe), zunehmend für andere, biologisch relevante Fragestellungen angewendet [5]. Interessante Beispiele sind u. a. der Nachweis der Verteilung von Agrarpestiziden in Sojabohnen [6], von Zuckerbestandteilen in Weizen [7], von relevanten Molekülen in Samen von Kulturgerste [8] und von Reis [9, 10] oder der Metabolitverteilung in Weintrauben [11].

In Abhängigkeit von der Größe der zu untersuchenden Probe, der lateralen Auflösung und des zu messenden Massenbereichs können beim Imaging leicht Datensätze in der Größenordnung von 107 – 109 Datenpunkten und Dateigrößen von mehreren GB erzeugt werden. Zu deren Auswertung werden daher verschiedene chemometrische Verfahren getestet, angewendet und diskutiert [12 – 18].

MALDI-Imaging-MS zur Identifizierung und Zuordnung von Pollenkörnern © BAM

Ein kritischer Punkt der MALDI-TOF-Massenspektrometrie und insbesondere der Imaging-Technik stellt die Auftragung der Matrix dar. Dies kann u. a. durch Pipettieren, Sprühen, Tropfen, Sublimieren, Drucken oder Eintauchen erfolgen [19 – 28]. Dabei ist es entscheidend, die Matrix so auf die Probe aufzubringen, dass einerseits die Analyten aus der Probe extrahiert werden, andererseits aber die lokale Position der Analytmoleküle bei der Auftragung nicht verändert wird [29].

Zur Fixierung der Pollenkörner wurde ein leitfähiges Karbonklebeband verwendet. Auf dieses wird die Matrixlösung aufgebracht, die, durch Zusatz einer Säure, gleichzeitig zur Extraktion der Analyten führte [30]. Die durch die Verwendung eines Klebebandes in einem Hochvakuum-Massenspektrometer (10-7 mbar) befürchteten Nachteile, wie schlechteres Vakuum durch Sublimation des Klebstoffes oder Veränderung der Probenhöhe und damit verbundene Massenverschiebung, können zum einen durch die Verwendung kleiner Spots reduziert und zum anderen durch den Einsatz geeigneter Mustererkennungsverfahren gänzlich vermieden werden.

Ergebnisse

In Bild 2 A ist ein Mikroskopiebild einer untersuchten Region gezeigt, das aus einer Mischung von drei Pollenarten mit jeweils fünf Pollenkörnern besteht. In dem Bild sind die Positionen der insgesamt 870 aufgenommenen Spektren mit einer Auflösung von 50 µm durch die rosafarbenen Punkte dargestellt. Diese Spektren ließen sich in einer Hauptkomponentenanalyse differenzieren (Bild 2 B/C). Aufgrund der Auflösung und der geringen Probenmenge zeigte die überwiegende Anzahl der Spektren lediglich Hintergrundsignale.

Bild 2: (A) Position der 870 Spektren eines Imaging-Datensatzes, die in B/C mit PCA ausgewertet wurden; in (B) gezeigt mit den Loading-Vektoren der ersten drei Hauptkomponenten. (C) illustriert die korrelierenden Score-Werte. © BAM

Der Loading-Vektor der ersten Hauptkomponente (PC 1, s. Bild 2 B oben) bildet die Hauptvarianz des Datensatzes ab. Der negative Bereich des PC1-Vektors enthält hauptsächlich verrauschte Signale, während im positiven Bereich verschiedene Peakmuster erkennbar sind. Deren Unterscheidung wird durch die Loading-Vektoren von PC 2 und PC 3 ermöglicht. Der positive Bereich im Loading von PC 2 ähnelt weitgehend dem positiven Bereich im Loading von PC 1. Die Ausnahme bildet das Peakmuster um m/z 4374, welches hier im negativen Bereich des Vektors zu finden ist. Eine weitere Differenzierung wird durch den Loading-Vektor der dritten Hauptkomponente (PC 3) deutlich. Hier ist der Unterschied zwischen spezifischen Peaks der Spezies 1 (bei m/z 3444, 5210 und 6884) und 2 (bei m/z 2946, 4106) klar ersichtlich. Die bildliche Darstellung der entsprechenden Scores ist in Bild 2 C illustriert. Hohe Score-Werte korrelierten mit den jeweils entsprechenden Bereichen des diskutierten Loading-Vektors. Sie zeigt die lokale Position der Spezies 1 (PC 3+) bzw. Spezies 2 (PC 3-) an.

Basierend auf diesen Ergebnissen wurden unabhängige MALDI-TOF-Referenzspektren der drei Pollenarten nach identischer Probenpräparation aufgenommen. Im ersten Schritt erfolgte wiederum eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) dieser Daten, die zu einer eindeutigen Differenzierung der drei Spezies (Bild 3 A) führte. Anhand der Score-Werte der Hauptkomponenten wurden Grenzwerte für jede Spezies definiert (gestrichelte Linien, Bild 3 B). Auf Basis dieser Differenzierung wurden, in Analogie zu einer bereits beschriebenen Vorgehensweise [31], die 870 Spektren des zuvor gezeigten Imaging-Datensatz in die Referenz-PCA projiziert (Bild 3 B). Im letzten Schritt erfolgte die Zuordnung der Ergebnisse dieser Projektion eines jeden Spektrums zu dessen lateraler Position (Bild 3 B, unten).

Ein Vergleich der in Bild 3 B (unten) dargestellten Positionen zeigt eine weitgehende Übereinstimmung mit Bild 2 C. Zusätzlich lassen sich jedoch auch die bislang fehlenden, zu Spezies 3 gehörenden Spektren identifizieren (Bild 3 B, gelbe Pixel).

Bild 3: (A) PCA von unabhängig-gemessenen MALDI-TOF-MS-Referenzspektren mit anschließender Projektion (B) der 870 Imaging-Spektren in diese Referenz-PCA. © BAM

Fazit
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Empfindlichkeit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie ausreichend für die Analyse einzelner Pollen verschiedener Spezies ist. Darüber hinaus hat sich MALDI-MSI von Pollenmischungen als geeigneter Ansatz erwiesen, einzelne Pollenkörner in Mischungen zu erkennen und zu identifizieren.

Da die Imaging-Spektren komplexe Informationen enthalten, ist eine multivariate Auswertung unerlässlich. Mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse (PCA) können Spektren anhand der vorhandenen spektrometrischen Variationen differenziert werden. Die Lokalisierung der Pollenkörner wird durch die Kombination dieser Informationen mit der räumlichen Position des jeweiligen Spektrums erreicht.

Die Klassifizierung der aufgenommenen Imaging-Spektren in Bezug auf Referenzspektren in einem varianzgewichteten PCA-Raum ermöglicht zudem eine unabhängige Identifizierung der Pollenkörner in den Gemischen.

Der hier vorgestellte Ansatz stellt eine neue, zuverlässige Methode zur Pollenbestimmung dar, die, im Gegensatz zur individuellen (optischen) Beurteilung, auf einer spektrometrisch-analytischen Methode beruht.

AUTOREN

Franziska Lauer
Steffen Weidner
Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung (BAM), Berlin

Janina Kneipp

Humboldt-Universität zu Berlin

Literatur
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