Liquid Biopsy

DNA-Methylierungsanalyse auf dem Vormarsch

DNA-Methylierungs-Biomarker werden immer häufiger zur minimal-invasiven (Tumor-) Diagnostik eingesetzt. Ein Überblick über Methoden zur DNA-Methylierungsanalyse.

© AIT

Das Thema „Liquid biopsy“, die Messung von Biomarkern in Körperflüssigkeiten, hat in den letzten Jahren eine wichtige Bedeutung in der Diagnostik erlangt, wobei die Analytik aus Blut hier mit Abstand die größte Rolle spielt. Diese Entwicklung wurde bzw. wird vornehmlich durch den klinischen Bedarf in der Onkologie getrieben. 

Unter dem Begriff „Liquid biopsy“ versteht man die Messung organspezifischer bzw. krankheitsspezifischer Signaturen, die im Blut bestimmt werden können. Die Gewinnung des zu untersuchenden Analyten erfolgt somit minimal-invasiv mittels Blutabnahme oder nicht-invasiv aus Urin, Speichel oder Stuhl. Die Analytik erfolgt durch Bestimmung krankheitsspezifischer Zellen, Proteine, Metaboliten oder von im Blutplasma frei zirkulierender DNA. 

Die große Herausforderung ist, krankheitsspezifische Marker vor dem „normalen“ Hintergrund zu finden. Beispielsweise können mittels PCR und Next-Generation-Sequencing (NGS) wenige Prozent von „mutierter“ krankheitsspezifischer Tumor-DNA (ctDNA, circulating tumor DNA) in der Gesamtheit zellfreier cfDNA nachgewiesen werden. Dazu bedarf es „universeller“ krankheitsspezifischer Marker, die in vielen Patienten gefunden werden. Da es keinen universellen Marker gibt, werden derzeit in der Onkologie viele verschiedene Genbereiche analysiert, die sehr häufig in Tumoren mutiert sind. Eine gute und interessante Alternative zur klassischen Mutationsanalyse von im Blut zirkulierender Tumor-DNA stellt die Analyse von ctDNA anhand der Gewebe- und Tumor-spezifischen DNA-Methylierungsmuster dar.

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Schlüsselfaktor Cytosin-Methylierung

Die Methylierung der Base Cytosin in der DNA-Sequenz ist ein Schlüsselfaktor zur epigenetischen Regulation der Genaktivität. Diese stellt ein im Genom von höheren Organismen weit verbreitetes Regulations-Prinzip dar (Bild 1). Die Gen- sequenz-Information bleibt durch methyliertes Cytosin (mC) unbeeinflusst. Das auch als „fünfte Base“ bezeichnete mC findet sich im humanen Genom ausschließlich in CpG-Dinukleotiden (CG-Abfolge; „p“ steht für das Phosphat-Rückgrat). In ca. 70 % aller Gene finden sich im 5‘ Genbereich sogenannte „CpG-Islands“ (ca. 28 000 im humanen Genom), welche DNA-Regionen mit einer hohen Dichte an CpG-Dinukleotiden aufweisen. Im 5‘ Genbereich um den Transkriptionsstart werden diese CpGs generell unmethyliert vorgefunden. Die Methylierungsmuster werden spezifisch und charakteristisch für bestimmte Zelltypen und Gewebe gesetzt und führen somit zur Entwicklung von vielen verschiedenen Zelltypen (> 200 im Menschen) bei identischer Genomsequenz.

Bild 1: Strukturformel von Cytosin (C) und 5-methyl-Cytosin (5mC). Finden sich in CG-reichen Regionen (wie z. B. in CpG Islands) von Genpromotor-Regionen vorwiegend mC-Reste, so ist dies mit einer Kondensierung des Chromatins verbunden. © AIT

Über die letzten zehn Jahre hat die Analyse der DNA-Methylierungsmuster besonders im Bereich der Krebsforschung große Bedeutung erlangt. Die Veränderung von DNA-Methylierungsmustern ist ein frühes Ereignis und wesentliches Charakteristikum bei der Entstehung von Tumoren.

Von der Biomarker-Discovery zur Diagnostik 

Zum Nachweis von mC in DNA eignen sich im Wesentlichen zwei Verfahren. Die erste Methode basiert auf methylierungssensitiven Restriktionsenzymen (MSRE), die methylierte DNA nicht schneiden können. Diese Methode wird jedoch im wissenschaftlichen und diagnostischen Umfeld zur Methylierungsanalyse weniger häufig verwendet. Das gängigere, zweite Prinzip zur mC Detektion ist die „Bisulfit-Deaminierung“. Hier wird die zu analysierende DNA chemisch mit Bisulfit deaminiert und unmethyliertes C in U umgewandelt, während mC erhalten bleibt. Auf diese Weise kann auf die Cytosin-Methylierung in der originären DNA-Sequenz geschlossen werden.

Die Suche nach krankheitsspezifischen DNA-Methylierungsveränderungen, die als diagnostische Biomarker eingesetzt werden können, beginnt i. d. R. mit einer „Discovery Study“, die genomweit die DNA-Methylierung von Probanden mit einer bestimmten Erkrankung mit jener einer gesunden Kontrollgruppe vergleicht (Beispiel Kolorektales Karzinom, s. Bild 3).

Bild 2: „Methpipe“ nennen die Autoren den Workflow und die dazugehörigen Methoden, die sie im Laufe der Jahre erarbeitet und etabliert haben, um von genomweiter Discovery­ zu minimal-invasiven DNA-Methylierungsassays für die Diagnostik aus zellfreier DNA zu gelangen. © AIT

Für genomweite Discovery-Studien werden aktuell vornehmlich zwei Technologien eingesetzt. Mit Infinium-Microarrays (Illumina) werden bei Einsatz von 500 ng Gesamt-DNA z. B. 850 000 CpGs verteilt über das ganze Genom analysiert. Obwohl die Infinium-Array-Reihe mit dem EPIC-Chip als seinem aktuellsten Vertreter den Methylierungsstatus von „nur“ 850 000 CpGs detektiert, gilt dieser Ansatz als epigenomweiter Ansatz und ist auch in Zeiten von NGS-basierten Lösungen der Goldstandard. Diese Microarray-basierte Methylierungsanalyse ist kostengünstig, schnell und ermöglicht vor allem eine effiziente und standardisierte Bearbeitung der Proben und Microarray-Daten.

Die relativ neue, NGS-basierte Reduced Representation Bisulfite Sequencing

(RRBS)-Methodik ist ein zweiter Ansatz für die epigenomweite Analyse. Die RRBS-Methodik erlaubt eine im Verhältnis zu Genomic Bisulfite-Sequencing (Bestimmung des DNA-Methylierungsstatus aller CpGs im gesamten Genom ) relativ kostengünstige Analyse von ca. 30 Millionen CpGs pro Probe. Das RRBS-Verfahren ist im Gegensatz zu Microarray-basierten Methoden aufwändiger, erfordert zudem in der Datenanalyse erfahrene Bioinformatiker und stellt an die IT-Hardware erhöhte Anforderungen.

Bild 3: A: Heatmap zur Darstellung unterschiedlich methylierter CpGs basierend auf Infinium-Array-Methylierungsanalysen von Tumor-DNA (rot, CRC = Kolorektales Karzinom) und Normal-Gewebe-DNA (grün, Controls). Die in die Analyse inkludierten Samples sind spaltenweise und die differenziell methylierten Genregionen (exemplarischer Auszug) reihenweise angeordnet. Aufgrund der gefundenen DNA-Methylierungsunterschiede können die Gruppen Normal- und Tumorgewebe getrennt werden, dies ist im PCA (Principle Component Analyse)-Plot (Bild 3B) dargestellt. © AIT

DNA-Methylierungsdaten zu verschiedensten Fragestellungen, die von der wissenschaftlichen Gemeinde generiert wurden, findet man frei zugänglich in Datenbanken bzw. in den zugehörigen Webpages. Die Klassiker unter diesen Datenbanken stellen sicherlich die GEO-Database (NCBI) und Array-Express (EMBL) dar. Mit dem Suchbegriff „DNA methylation“ liefern beide Datenbanken aktuell ca. 15 000 Datensätze mit DNA-Methylierungsbezug, wobei z. B. ca. 3 700 Datensätze in GEO Infinium-Array-Analysen zuzurechnen sind.

Werkzeuge zur Bestätigung und Marker-Selektion 

Um die in genomweiten Analysen definierten Methylierungsunterschiede weiter zu bestätigen, werden PCR-, Hybridisierungs- oder sequenzierbasierte Verfahren eingesetzt, die auf den Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen und Genregionen abzielen. Hier sind Bisulfit-basierte Ansätze am weitesten verbreitet. Diese umfassen methylierungssensitive PCR (MSPCR), Pyrosequencing, Targeted Deep Amplicon Bisulfite Sequencing (TDBS), und auch die Massenspektrometrie-basierte Epityper-Technologie (Methodenübersicht s. Noehammer et al. 2014, Egger et al. 2012). All diese Methoden basieren auf der spezifischen Amplifikation von Bisulfit-deaminierter DNA, wobei die Differenzierung zwischen C/U zur Bestimmung des Methylierungsunterschiedes (mC/C) herangezogen wird. Die Eignung der einen oder anderen Methode zur Methylierungsanalyse hängt von verschiedenen analytischen und projektspezifischen Anforderungen ab:

  • Wieviele Regionen sollen parallel analysiert werden?
  • Muss der mC/C-Gehalt einzelner Cs definiert werden?
  • Wie viele Proben sollen über welchen Sequenzbereich analysiert werden? 


Bei klinischen Arbeiten sollten insbesondere folgende Fragen erwogen werden:

  • Ist ausreichend DNA vorhanden?
  • Stammt die DNA aus Formalin-fixiertem oder nativ gefrorenem Gewebe?
  • Soll die Analyse aus Biopsie-Material, einzelnen Zellen (z. B. zirkulierenden Tumor-Zellen), cfDNA oder ctDNA aus Plasma erfolgen? 
  • Wie sehen die weiteren Pläne und Ziele aus?

So kann jede der genannten Methoden abhängig von diesen Rahmenbedingungen mehr oder weniger passend sein. MSPCR und Pyrosequenzierung eignen sich besonders für die Analyse weniger Target-Regionen und eine hohe Probenzahl. Epityper sowie TDBS sind für eine höhere Anzahl von Target-Regionen mit weniger Proben besser geeignet.

Meist geht man in der Biomarker-Forschung sequenziell vor, so dass eine Zahl von 100 – 200 Kandidaten-Regionen mit z. B. TDBS bestätigt wird und dann MSPCR für die bestätigten Marker zur Analyse von großen Probenzahlen eingesetzt wird. In vielen Fällen ist man natürlich an einer möglichst hohen Auflösung, sprich der Methylierungsinfo jedes einzelnen Cytosins in einer Sequenz interessiert, wie dies z. B. Epityper, Pyrosequenzierung sowie TDBS liefern können. Eine derartige hohe Auflösung ist jedoch für viele diagnostische Anwendungen oft nicht nötig.

Wir haben dazu einen alternativen MSRE-basierten Ansatz etabliert, der besonders gut multiplexing-fähig ist und die Analyse einer Vielzahl von Genregionen unter Einsatz minimalster Mengen von DNA erlaubt. Nach MSRE-Verdau und Präamplifikation mit bis zu 96 Primer-Paaren können aus den Präamplifikations-Produkten in einzelnen PCRs die Methylierungsunterschiede bestimmt werden. Über die letzten zehn Jahre haben wir diesen Workflow (Bild 2) optimiert, hierzu auch einige Primerdesign-Software-Tools entwickelt (Pandey et al., 2016a, 2016b) und für hunderte verschiedene Genbereiche PCR-Assays entwickelt und in verschiedensten humanmedizinischen Fragestellungen eingesetzt.

Die PCR-Reaktionen führen wir typischerweise in einem Nanoliter-Microfluidic-PCR-Array-Format durch und verwenden dazu das Biomark-System von Fluidigm. Damit können aus wenig DNA-Ausgangsmaterial einige hundert Methylierungsregionen an vielen Proben parallel analysiert werden. Diese (high-throughput) HT-MSRE-qPCR ist zurzeit die beste und einzig praktikable Methodik, um z. B. Tumor-DNA, die in 0,1 – 1  % in cfDNA aus Plasma zu finden ist, über DNA-Methylierungsmarker nachzuweisen. Besonders hilfreich ist dieser Ansatz für die Selektion der Marker. So kann aus 2 – 4 ml Plasma ausreichend cfDNA gewonnen werden, um die geeignetsten Methylierungsmarker aus 100 – 200 Kandidatenmarkern in cfDNA von klinischen Proben zu definieren. Damit kann eine engere Markerauswahl getroffen und für Liquid-Biopsy-Applikationen weiter validiert werden. Dieser MSRE-basierte Ansatz funktioniert auch aus FFPE (Formalin fixed paraffin embedded)-Proben und ist eine günstige Alternative zur bisulfit-basierten Methylierungsanalyse (Pulverer et al., 2014).

Ist man bezüglich der Verfügbarkeit von DNA weniger eingeschränkt, können aus ca. 500 ng DNA nach Bisulfit-Deaminierung und PCR-Amplifikation mit TDBS die Methylierungsfrequenzen einzelner CpGs aufgelöst werden. Multiplexing ist zumeist nur eingeschränkt möglich. Nach unseren Erfahrungen kann mit der richtigen Kombination von verschiedenen Primern ein Multiplexing von etwa 25 Genbereichen gelingen. Somit sind für die meisten Fragestellungen heutzutage geeignete Methoden verfügbar. Die Empfehlung zur Methode der Wahl hängt, wie schon zuvor erwähnt, von projektspezifischen Faktoren und Zielsetzungen ab.

Bedeutung für die Klinik

Prominente Beispiele für den klinischen Einsatz von DNA-Methylierungsbasierten Biomarkern finden sich im Bereich der Krebsdiagnostik. Die im klinischen Setting für die Tumordiagnostik am leichtesten zugänglichen Proben umfassen zum einen Formalin-fixierte Gewebeproben und zum anderen Blutplasmaproben, aus denen cTDNA bzw. cfDNA isoliert werden können. Die hohe Stabilität von DNA sowie die Möglichkeit, geringste Mengen an DNA über PCR-Methoden zu amplifizieren, erlauben den Nachweis spezifisch methylierter Tumor-DNA sogar bei einem hohen Hintergrund an „Nicht-Tumor-DNA“ und übertreffen dabei die Nachweiswahrscheinlichkeiten der klassischen Mutationsanalysen an zirkulierender Tumor-DNA.

Beispiele für bereits kommerziell erhältliche Methylierungsassays sind der Epi proColon®- und der Epi proLung®-Test. Erstgenannter ist der erste und bislang einzige FDA-zugelassene Bluttest zur Früherkennung von Darmkrebs, basierend auf dem Methylierungsnachweis des SEPT9-Gens. Epi proLung ist ein CE-zertifizierter Lungenkrebstest, der auf den DNA-Methylierungs-Biomarkern SHOX2 und PTGER4 beruht. Neben der Tumorfrühdiagnostik gibt es auch Beispiele für methylierungsbasierte Tests, die zur Therapieentscheidung eingesetzt werden, wie beispielsweise die Testung auf MGMT-Promoter-Methylierung, welche mit besserer Prognose und Chemotherapieansprechen bei Glioblastom-Patienten assoziiert ist (Pulverer et al. 2014).

Aufgrund der Tatsache, dass DNA-Methylierung gewebespezifisch ist, finden DNA-Methylierungsbasierte Tests auch zunehmend in anderen Krankheitsindikationen Anwendung. So konnten z. B. DNA-Regionen, die spezifisch in Cardiomyozyten unmethyliert sind, herangezogen werden, um bei Herzinfarkt-Patienten einen spezifischen Anstieg entsprechender Herzzellen-spezifischer DNA nachzuweisen. Das gleiche Prinzip konnte auch genützt werden, um anhand Leberzell-spezifischer Methylierungsmarker eine Schädigung der Leber mit einer Blutprobe zu detektieren. Nicht zuletzt gibt es auch zur Diagnostik von Transplantat-Abstoßung und dem nicht-invasiven pränatalen Testing (NIPT) bereits Ansätze, die auf DNA-Methylierungsanalysen beruhen.

Die DNA-Methylierungsanalyse wurde bereits vor etwa 15 Jahren zur Diagnostik von Imprinting-Erkrankungen in der Humangenetik angewendet und hat nunmehr den Eingang in die Diagnostik häufiger Erkrankungen gefunden. Aufgrund der breiten Anwendungsmöglichkeiten ist mit einer zunehmenden Bedeutung von nicht-invasiven DNA-Methylierungstests in naher Zukunft zu rechnen.

AUTOREN

Dr. Christa Nöhammer
Dr. Walter Pulverer
PD Dr. Andreas Weinhäusel

Molecular Diagnostics Unit
AIT Austrian Institute of Technology GmbH, Wien

http://www.ait.ac.at

Referenzen:

Egger G et al. (2012). DNA methylation testing and marker validation using PCR: diagnostic applications. Expert Rev Mol Diagn. 12:75-92. doi: 10.1586/ERM.11.90. Review.

Noehammer C et al. (2014). Strategies for validation and testing of DNA methylation biomarkers. Epigenomics, 6, 603. doi: 10.2217/epi.14.43.

Pandey RV et al. (2016a). MSP-HTPrimer: a high-throughput primer design tool to improve assay design for DNA methylation analysis in epigenetics. [Research Support, Non-U.S. Gov‘t]. Clin Epigenetics, 8, 101. doi: 10.1186/s13148-016-0269-3.

Pandey RV et al. (2016b). MSRE-HTPrimer: a high-throughput and genome-wide primer design pipeline optimized for epigenetic research. [Research Support, Non-U.S. Gov‘t]. Clin Epigenetics, 8, 26. doi: 10.1186/s13148-016-0190-9.

Pulverer W et al. (2014). A simple quantitative diagnostic alternative for MGMT DNA-methylation testing on RCL2 fixed paraffin embedded tumors using restriction coupled qPCR. [Research Support, Non-U.S. Gov‘t]. Clin Neuropathol, 33(1), 50-60. doi: 10.5414/NP300633.

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