Fachbeitrag

Rapid Resolution LC

Produktivitätssteigerung durch ultra-schnelle und hochauflösende Analytik mit 1,8-µm-Partikeln

Ulrike Jegle*), John Henderson

  1. Angelika Gratzfeld-Hüsgen*)
  1. Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland. E-Mail: ulrike_jegle@agilent.com.
  1. Agilent Technologies, Wilmington, USA.
Rapid Resolution Liquid Chromatograpy (RRLC) erlaubt sowohl schnelle (Minutenbereich) und ultra-schnelle Trennungen (Sekundenbereich) mit kurzen Säulen als auch hochauflösende Trennungen mit entsprechend langen Säulen. Die Analysen werden unter Erhalt der Trenneffizienz schneller und sicherer, die Produktivität dadurch gesteigert und die Kosten pro Analyse deutlich gesenkt.
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Eines der Kernstücke der RRLC, neben Optimierungen der LC-Instrumentierung (z.B. bezüglich Druck und Totvolumen), ist der Einsatz extrem kleiner Partikelgrößen (sub2micron). Für kleinste Partikel wird der Massentransfer zwischen und in den Partikeln durch eine Reduktion der Diffusionswege optimiert, so dass höchste Trennstufenzahlen, also geringste Peakbreiten, erreicht werden können. Trenneffizienzen von 12000 Böden und mehr für 50 mm lange Säulen sind Realität und entsprechen damit der Trennleistung einer 150 mm langen Säule gepackt mit 5-µm-Partikeln.

Kleinste Partikel: 1,8 µm

Neben den erzielbaren hohen Trenneffizienzen weisen die 1,8-µm-Partikel einen weiteren entscheidenden Vorteil auf. Sie unterliegen im Gegensatz zu den größeren Partikeln (5 µm) einer deutlich geringeren Abhängigkeit der Flussrate. Durch die Optimierung des Massentransfers bleibt die hohe Trennstufenzahl auch bei höheren Flussraten von 3...5 ml/min (bezogen auf Säulendurchmesser von 4,6 mm) erhalten. Die höheren Flussraten dienen genauso wie die kürzeren Säulen einer signifikanten Beschleunigung der Analysenzeiten.

Grundsätzlich sind demnach kleinste Partikel erstrebenswert, würde nicht auch gleichzeitig mit der Reduktion der Partikelgröße der Rückdruck der Säule signifikant ansteigen. Um dieser unerwünschten Nebenwirkung zu begegnen, setzt Agilent Technologies eine speziell optimierte Partikelgrößenverteilung für die Materialien mit 1,8 µm ein, die eine ca. 30-% ige Reduktion des Säulenrückdrucks, verglichen zu klassischen Korngrößenverteilungen, ermöglicht, ohne nennenswert diese hohen Bodenzahlen zu beeinflussen.

Was ist der praktische Vorteil dieser Korngrößenoptimierung? Höchste Trenneffizienz bei moderaten Drücken. Ein Teilbereich der RRLC ist damit Anwendern klassischer LC-Systeme (Agilent Series 1100 und 1200 Standard, 400 bar) zugänglich. Die Abdeckung des Gesamtbereiches sowohl für ultra-schnelle als auch für hochauflösende Analytik der RRLC ist allerdings nur mit Druck- und Totvolumen optimierten LC-Systemen, also einem Rapid Resolution-LC-System (Agilent 1200 Series RRLC, 600 bar) zugänglich.
Anhand der im Folgenden beschriebenen Optimierung einer Barbiturat-Analyse wird die Leistungsfähigkeit der ZORBAX-Phasen in Kombination mit einem Agilent RRLC-System demonstriert.

Optimierungsbeispiel Barbiturate

Barbiturate wie Phenobarbital werden als Beruhigungs- und Schlafmittel sowie als Sedativa im klinischen Bereich eingesetzt. Sie wirken je nach chemischem Aufbau mit unterschiedlicher Dauer und Stärke auf das zentrale Nervensystem. Insbesondere kurzzeitig wirkende Barbiturate bergen die Gefahr der Abhängigkeit. Die schnelle Analyse von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten ist essentiell zur Untersuchung von Bewusstlosigkeits- oder Vergiftungzuständen.

Die Analyse von Phenobarbital ist eine etablierte, robuste Methode (USP27), die im Folgenden beispielhaft und schrittweise zu einer Hochdurchsatzmethode optimiert werden soll. Neben Phenobarbital werden der Probe weitere Barbiturate mit unterschiedlicher Wirkungsdauer zugesetzt, um den Optimierungsspielraum demonstrieren zu können [1].

Die klassische Analyse dieser Substanzen wird laut Pharmacopea auf einer 4,6 x 250 mm L1-Typ-Säule (C18-Phase), gepackt mit 5-µm-Partikeln, durchgeführt. Gefordert wird eine Mindestauflösung von 1,2 für die kritischen Peakpaare.

Für das hier gezeigte Beispiel wird die ZORBAX Eclipse XDB C18-Phase in verschiedenen Säulendimensionen und Partikelgrößen eingesetzt.

Unter klassischen Bedingungen mit einer Eclipse XDB C18, 4.6 x 250 mm, 5 µm, wird eine Analysendauer von 32 min erzielt. Der schrittweise Ersatz dieser Säule durch Säulen geringerer Länge (100 und 50 mm) bei gleichzeitiger Reduktion der Partikelgröße über 3,5 µm zu 1,8 µm, reduziert die Analysenzeit auf 7 min unter Erhalt der geforderten Mindestauflösung (Bild 1).

Mit der Verkürzung der Analysenzeit geht eine Reduktion des Lösungsmittelverbrauchs auf ca. 1/5 der ursprünglichen Menge einher (Bild 1).

Einen weiteren Optimierungsschritt stellt die Erhöhung der Flussrate dar, da bei Verwendung von 1,8-µm-Partikeln praktisch kein Trenneffizienzverlust beim Einsatz hoher Flussraten auftritt. Durch Verdoppelung der Flussrate von 1 ml/min auf 2 ml/min wird eine Halbierung der Analysenzeit erzielt bei gleichbleibender, hier sogar erhöhter Trenneffizienz (Bild 2).

Gerade der Einsatz hoher Flussraten zur Beschleunigung der Analytik scheint vor dem aktuellen Hintergrund der Knappheit und damit Preiserhöhung der Lösungsmittel (ACN) ein fraglicher Optimierungsparameter. Agilent bietet seit langem ein Lösungsmittelsparkonzept mit sogenannten Solvent-Saver- und Narrow-Bore-Säulen an. Dies sind Säulen mit 3 mm und 2,1 mm Innendurchmesser (id), die bei identischen Ergebnissen eine Ersparnis von ca. 50 % bzw. bis zu 80 % ermöglichen [2]. Diese Säulen sind auch mit 1,8-µm-Partikeln verfügbar. Der Einsatz von Narrow-Bore-Säulen verlangt allerdings eine Optimierung der Instrumentierung bezüglich des Totvolumens, während 3-mm-id-Säulen mit Standard-LC-Systemen wie dem Agilent Series 1100 und 1200 Standard benutzt werden können.

Die für das angeführte Beispiel zu verwendenden Flussraten in Abhängigkeit vom Innendurchmesser der Säule sind in Tab. 1 aufgeführt.

Trotz der Optimierungen der physikalischen Trennparameter, wie Partikelgröße und Flussrate der chromatographischen Trennung, bleibt die Selektivität der herausragende Faktor zum Erfolg einer Analyse. Deshalb ist und bleibt gerade für die Rapid Resolution Chromatographie ein breites Spektrum an unterschiedlichsten stationären Phasen unerlässlich. Agilent Technologies bietet für die RRLC drei verschiedene ZORBAX-Phasenfamilien, genannt StableBond, Eclipse XDB und Eclipse Plus mit den jeweiligen Unterselektivitäten C18, C8, C3, Phenylhexyl, CN, Aq und anderen, sowie zwei Einzelphasen Bonus RP und Extend C18 an. Mit den jeweiligen Phasen und Säulendimensionen sind damit mehr als 150 verschiedene Selektivitätsoptionen für praktisch jede Trennaufgabe verfügbar [3].

Fazit

Die hohe Trennleistung von Säulen, gepackt mit 1,8-µm-Partikeln, macht diese zu einem idealen Werkzeug für hochauflösende sowie schnelle Trennungen. Die Säulen finden damit Einsatz in der LC mit UV-, Fluoreszenz- und MS-Detektion, für Analysen pharmazeutischer Wirkstoffe ebenso wie für Naturstoffanalysen, für hohen Probendurchsatz in der Qualitätskontrolle und der kombinatorischen Chemie sowie in der Prozessanalytik.

Literatur

  1. J.W. Henderson, C.Woodward, R.E. Majors, High Throughput HPLC Analysis of Barbiturates, Agilent Technologies, PubNr. 5989-5092EN.
  2. A. Gratzfeld-Hüsgen, Reducing Solvent Consuption, Agilent Technologies, PubNr. 5990-3472EN.
  3. Agilent ZORBAX Column Selection Guide, Agilent Technologies, PubNr. 5989-5992EN.
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