Stabilisotopenverdünnungsanalyse

Folate in Lebensmitteln

Bestimmung mittels Stabilisotopenverdünnungsanalyse und LC-MS/MS. Die Gruppe der Folate zeichnet sich durch eine Vielzahl an Verbindungen aus. Für eine selektive Bestimmung der Vitamere werden LC-Methoden mit MS-Detektion und stabilisotopenmarkierten Standards eingesetzt. Eine neue sensitive und validierte Methode koppelt LC-MS/MS 8050 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer mit einer Nexera X2 UHPLC, um die Hauptvitamere in Lebensmitteln durch Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIDA) mittels 13C-markierten Isotopologen zu quantifizieren.

Die Vitamine der Folsäuregruppe gehören zu den wasserlöslichen Vitaminen und sind im Stoffwechsel vor allem als Coenzyme bei der Übertragung von Methylgruppen beteiligt. Sie erfüllen essenzielle Funktionen im Stoffwechsel der Aminosäuren und Nukleinsäuren [1]. Ursachen für einen Folatmangel können eine ungenügende Zufuhr sein, aufgrund von Mangelernährung und Resorptionsstörungen, eines erhöhten Bedarfs während Wachstumsprozessen, Schwangerschaft oder Stillzeit, sowie einer erhöhten Ausscheidung und Interferenzen mit Medikamenten [2]. 

Hülsenfrüchte, Getreidekeime, dunkle Blattgemüse, Kalbs- und Geflügelleber – die Folat-Zufuhr über diese folatreichen Lebensmittel ist in Deutschland nicht ausreichend. Nur durchschnittlich zwei Drittel der täglich empfohlenen Menge nimmt die Bevölkerung zu sich. Ein Folatmangel bei Frauen im gebärfähigen Alter gilt als Risikofaktor für den sogenannten Neuralrohrdefekt, einer Missbildung bei Neugeborenen [3]. Daneben wird eine Korrelation einer Unterversorgung diskutiert mit der Anfälligkeit von Herzkreislauferkrankungen [4], Krebserkrankungen, wie Brust-, Darm-, Lungen- oder Gebärmutterhalskrebs [5] und der Alzheimer Erkrankung [6].

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Folate können vom menschlichen Körper nicht selbst gebildet werden und müssen somit mit der Nahrung zugeführt werden. Der Bedarf wird über die Nahrung nur unzureichend gedeckt (siehe Infokasten). Aus diesem Grund werden in einigen Ländern Grundnahrungsmittel prinzipiell angereichert. In den USA gab es sogar eine Verpflichtung der US Food and Drug Administration (FDA), Lebensmittel auf Getreidebasis anzureichern [7]. Dadurch konnte eine Steigerung der Folat-Zufuhr und ein Rückgang an Neuralrohrdefekten verzeichnet werden. Dieser Ansatz wird jedoch vermehrt auch kontrovers diskutiert, da unter anderem die Gefahr einer Maskierung der hämatologischen Symptome eines Vitamin B12-Mangels besteht, was zu neurologischen Schäden führen kann. Aus diesem Grund ist es umso wichtiger, den Folatgehalt in Lebensmitteln mit einer sicheren Analytik zu quantifizieren. 

Bild 1: Strukturen der natürlichen Folate und deren von der Folsäure abgeleiteten Variationsmöglichkeiten.

Die Stoffgruppe der Folate
Die Folat-Vitamere sind eine Gruppe etlicher verschiedener Verbindungen. Die Folsäure, auch Pteroylmonoglutaminsäure (PteGlu) genannt, bildet das Grundgerüst der Folsäurevitamere. Sie besteht aus einem Pteringerüst, der p-Aminobenzoesäure und der Glutaminsäure.

Ausgehend von dieser Struktur gibt es noch verschiedene Variationsmöglichkeiten der Folate hinsichtlich ihrer Oxidationsstufe sowie der Art und Verknüpfung mit C1-Resten. Neben den verschiedenen Pteroylmonoglutamaten liegen in Lebensmitteln vor allem Pteroylpolyglutamate vor. Diese weisen ein bis acht Glutamylreste im Molekül auf. Die Polyglutamate dienen im menschlichen Körper als Speicherform, während die Monoglutamate die Transportform im Körper darstellen.

Bild 2: Probenvorbereitung mit Stabilisotopenverdünnungsanalyse.

Da nur die isotopenmarkierten internen Standards der Monoglutamate käuflich zu erwerben sind und somit mittels Stabilisotopenverdünnungsanalyse quantifiziert werden können, müssen die Polyglutamate durch entsprechende Hydrolasen oder Konjugasen in die Monoglutamate gespalten werden. In dieser Arbeit wurden Folsäure (PteGlu), 10-Formylfolsäure (10-CHO-PteGlu), Tetrahydrofolat (H4folat), 5-Methyltetrahydrofolat (5-CH3-H4folat) und 5-Formyltetrahydrofolat (5-CHO-H4folat) untersucht.

Analytik von Folaten in Lebensmitteln
Die große Vielfalt an verschiedenen Folat-Derivaten und deren hohe Empfindlichkeit gegenüber Licht, Wärme und Oxidation macht die Analytik der Folate besonders herausfordernd. Um einzelne Folatvitamere zu bestimmen, hat sich die LC-MS/MS-Analytik als selektive und sensitive Methode durchgesetzt. Sie hat gegenüber bioanalytischen und mikrobiologischen Methoden den Vorteil, dass die einzelnen Vitamere unterschieden werden. Folate sind stark oxidationsempfindliche Substanzen und unterliegen Verlusten bei der Aufarbeitung.

Bild 3: Exemplarische LC-MS/MS-Chromatogramme, A: Response, B: Erdbeerprobe, C: Hefeprobe, D: Algenprobe (Spirulina platensis).

Aus diesem Grund und um Störungen sowie Matrixeffekte bei der Ionisation zu kompensieren, wird eine Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA) unter Verwendung von 13C-markierten Isotopologen als interne Standards durchgeführt. Diese werden den Proben zu Beginn der Extraktion in bekannter Konzentration zugefügt. Aufgrund der annähernd identischen physikalischen und chemischen Eigenschaften bleibt das Verhältnis von Analyt zu markiertem internen Standard über den Aufarbeitungsprozess gleich.

Durch die selektive massenspektrometrische Detektion lassen sich markiertes und natürlich enthaltenes, unmarkiertes Folat unterscheiden und über deren Verhältnis kann die Konzentration der natürlichen Vitamere berechnet werden. Verluste bei der Aufarbeitung werden so einfach kompensiert. Das Prinzip der Probenvorbereitung mit enzymatischer Spaltung der Polyglutamate, Aufreinigung durch Festphasenextraktion sowie der Verwendung der internen Standards ist in Bild 2 zu sehen. 

Bild 4: Verteilung der Folate in den untersuchten Lebensmitteln.

LC-MS/MS-Analytik
Die Analytik wurde auf einer Nexera X2 UHPLC, gekoppelt mit einem LC-MS/MS-8050-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer entwickelt und durchgeführt. Die Trennung der Analyten erfolgte auf einer Restek Raptor ARC18 Core-Shell-Säule mit einem binären Hochdruckgradienten mit Acetonitril/H2O, jeweils mit 0,1 % Ameisensäure versetzt. Die Detektion erfolgte über ein Triple-Quadrupol-Massenspektrometer, wobei bei positiver Ionisierung jeweils zwei MRM-Übergänge für alle Analyten gemessen wurden. Die Validierung der Methode ergab Nachweisgrenzen von 0,17–0,32 µg/100 g und Bestimmungsgrenzen von 0,51–0,93 µg/100 g. Die Extraktion zeigte gute Wiederfindungen im Bereich von 81,9–101 % und Wiederholpräzisionen mit relativen Standardabweichungen (RSD) von 3,04–5,06 %.

Das Shimadzu 8050 Massenspektrometer zeigte Messpräzisionen mit einer RSD von 4,82–5,12 %.

Untersuchung von Lebensmittelproben
Mit der hier beschriebenen Methode wurden verschiedene Proben auf ihren Folatgehalt untersucht. Ein Augenmerk wurde auf die Untersuchung natürlicher, nicht angereicherter Lebensmittel gesetzt. Erdbeeren gehören zu den bekanntesten Früchten weltweit und werden in frischer, aber auch verarbeiteter Form verzehrt, etwa in Joghurt, Marmeladen, Nachspeisen oder Säften. Der hohe Nährwert von Erdbeeren wird auf ihren hohen Gehalt an Mikronährstoffen wie Mineralien, Vitamin C und Folaten zurückgeführt. Vor allem aber die antioxidative Wirkung der in Erdbeeren enthaltenen Phytochemikalien hilft unter anderem Herz-Kreislauferkrankungen und Krebs vorzubeugen [8]. Bei Erdbeeren wurde ein Gesamtfolatgehalt von 104 µg/100 g analysiert.

Für den Folatgehalt exotischer Früchte gibt es kaum wissenschaftlich basierte Daten. Es wurden die relativ bekannten Früchte Passionsfrucht und Papaya untersucht, die auch auf lokalen Märkten leicht erwerbbar sind. Bei der Passionsfrucht wurde ein relativ hoher Folatgehalt von 151 µg/100 g bestimmt. Bei der Papaya hingegen konnten nur 78,2 µg/100 g gemessen werden. Bei allen untersuchten Früchten wurde das 5-CH3-H4folat als Hauptvitamer bestimmt.

Tab. 1: Folate – Massenübergänge und Kollisionsenergien am LC-MS/MS 8050.

Neben Früchten wurde auch noch eine Hefe analysiert. Hefen werden seit Jahrtausenden zum Backen und Bierbrauen verwendet. Neben den gärenden Eigenschaften sind Hefen auch ein bedeutender Nährstofflieferant. Insbesondere B-Vitamine sind reichlich enthalten, aber auch andere Vitamine und Mineralstoffe.

Bei der Hefe wurden 5910 µg/100 g, bezogen auf das Trockengewicht ermittelt. Neben dem Hauptvitamer 5-CH3-H4folat sind hier auch das H4folat und das 5-CHO-H4folat mit relativ hohem Anteil vertreten. Der sehr hohe Folatgehalt muss allerdings mit den normalen Verzehrsbedingungen in Relation gesetzt werden. Die Folate der Hefen werden meist nur in kleinen Mengen über den Verzehr in Brot oder anderen Backwaren aufgenommen.

Auch bekannt als „Superfood“, erfahren neuerdings Algen wie Spirulina oder Chlorella einiges an medialer Aufmerksamkeit und werden vermehrt als Nahrungsergänzungsmittel eingesetzt. Grund dafür ist, dass ihnen diverse positive Gesundheitseffekte nachgesagt werden. Beispielsweise sollen Sie sich positiv auf das Immunsystem auswirken, entzündungshemmend sein sowie durch das enthaltene Chlorophyll antioxidativ und antikanzerogen wirken. Außerdem sind sie ebenfalls reich an Mineralstoffen, Spurenelementen und Vitaminen.

Algen zeigten mit 2230 µg/100 g bei Chlorella vulgaris sowie 1060 µg/100 g bei Spirulina platensis erwartungsgemäß hohe Folatgehalte. Das Muster ist hier im Vergleich zu den untersuchten Früchten und bekannten Werten für andere Lebensmittel ein zum Teil anderes. Bei der Chlorella-Alge zeigte sich 5-CHO-H4folat als Hauptvitamer, während es bei Spirulina platensis das 5-CH3-H4folat war.

Fazit
Mit Bestimmungsgrenzen von <1 µg/100 g Lebensmittel wurde eine sensitive Methode zur Bestimmung von Folaten in Lebensmitteln entwickelt und validiert. Die hochselektive Messung mit einem Triple-Quadrupol-Massenspektrometer und der Einsatz von stabilisotopenmarkierten Standards gewährleisten eine sichere und empfindliche Quantifizierung der verschiedenen Folat-Vitamere.


Literatur
[1] Selhub, J. (2002). Folate, vitamin B12 and vitamin B6 and one carbon metabolism. J Nutr Health Aging, 6(1), 39-42.
[2] Dunkelberg, H.; Gebel, T.; Hartwig, A. (2013): Vitamine und Spurenelemente. Bedarf, Mangel, Hypervitaminosen Und Nahrungsergänzung. Weinheim: Wiley. Online verfügbar unter http://gbv.eblib.com/patron/FullRecord.aspx?p=1170562.
[3] Czeizel, A. E., & Dudas, I. (1992). Prevention of the 1st Occurrence of Neural-Tube Defects by Periconceptional Vitamin Supplementation. New England Journal of Medicine, 327(26), 1832-1835.
[4] Robinson, K. (2000). Homocysteine, B vitamins, and risk of cardiovascular disease: Heart.
[5] Duthie, S. J. (2011): Folate and cancer: how DNA damage, repair and methylation impact on colon carcinogenesis. In: Journal of inherited metabolic disease, Vol. 34: 101-109.
[6] Snowdon, D. A., Tully, C. L., Smith, C. D., Riley, K. P., & Markesbery, W. R. (2000). Serum folate and the severity of atrophy of the neocortex in Alzheimer disease: findings from the Nun study. American Journal of Clinical Nutrition, 71(4), 993-998.
[7] Shane, B. (2003): Folate fortification: enough already? In: The American Journal of Clinical Nutrition, 77: 8–9.
[8] Hannum, S. M. (2004). Potential impact of strawberries on human health: a review of the science. Crit Rev Food Sci Nutr, 44(1), 1-17.
[9] Deutsche Gesellschaft für Ernährung e.V. (DGE) (2013): Referenzwerte für Folate.

Dr. Nina Firl
Shimadzu Deutschland GmbH
E-Mail: info@shimadzu.de
http://www.shimadzu.de

Soraya Chebib
Lisa Striegel
TU München
Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie Freising

Prof. Dr. Michael Rychlik
TU München
Lehrstuhl für Analytische Lebensmittelchemie Freising
University of Queensland
Centre for Nutrition and Food Sciences
Brisbane, AUS


Folate: Verzehrsempfehlung und Versorgung
Die Deutsche Gesellschaft für Ernährung hat aufgrund aktueller Einschätzungen für die Folat-Zufuhr den Referenzwert auf 300 μg pro Tag festgesetzt. Darüber hinaus wird allen Frauen in gebärfähigem Alter empfohlen, täglich zusätzlich 400 μg Folsäure, z.B. durch Nahrungsergänzungsmittel, zu sich zu nehmen [8]. Durch Ernährungserhebungen hat sich aber herausgestellt, dass die Bevölkerung in Deutschland die Zufuhrempfehlungen häufig nur unzureichend befolgt und durchschnittlich nur 67 % der täglich empfohlenen Menge zu sich nimmt. Aus diesem Grund werden in einigen Ländern Grundnahrungsmittel prinzipiell angereichert. Dieser Ansatz wird jedoch vermehrt kontrovers diskutiert, da Nebenwirkungen nicht ausgeschlossen werden können.

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