HPLC-Methode

Taurin und Zucker in Energydrinks bestimmen

HPLC-Anwendungsspezialist Eckert von VWR International beschreibt eine Methode zum Bestimmen von Taurin und Zuckern in Energydrinks und zeigt Untersuchungsergebnisse.

© bischy/www.stock.adobe.com

Den meisten Menschen ist Taurin ein Begriff im Zusammenhang mit Energydrinks. Doch Taurin (2-Aminoethansulfonsäure) ist nicht nur belebend und anregend, sondern es erfüllt als natürlich vorkommende Verbindung im Körper wichtige Funktionen. Taurin hat zahlreiche physiologische Effekte und ist in seiner Funktion als Neurotransmitter an der Entwicklung des Gehirns und Sehapparats beteiligt. Es wirkt als Antioxidans, schützt den Herzmuskel und hält zahlreiche Organfunktionen aufrecht. Doch die zusätzliche Aufnahme von Taurin sollte bestimmte Mengen nicht überschreiten. Die Höchstmenge von Taurin in verzehrfertigen koffeinhaltigen Getränken liegt für Taurin bei 4 000 mg/l.

Aminosäuren oder andere Substanzen, die eine freie Aminogruppe enthalten, werden oft durch gängige Reagenzien wie ortho-Phthaldialdehyd (OPA), 9-Fluorenyl-methoxycarbonyl-chlorid (FMOC) oder Dansylchlorid derivatisiert, um die zu bestimmenden Analyten in optisch aktive Derivate umzusetzen, die dann empfindlich mit Hilfe von Fluoreszenz- oder UV-Detektoren nachgewiesen werden können. Die Derivatisierung kann entweder vor der Säule (Vorsäulenderivatisierung) oder nach der Auftrennung durch die Säule (Nachsäulenderivatisierung) erfolgen. In beiden Fällen entsteht durch die Derivatisierung ein erheblicher Aufwand. Die Labore in der Getränkeindustrie stehen oft unter erheblichem Zeit- und Kostendruck. Daher wird die Durchführung aufwändiger Probenvorbereitungsschritte vermieden, wenn es möglich ist. Im Folgenden werden Untersuchungen zur direkten Bestimmung von Taurin sowie den Hauptzuckern beschrieben. Hier sind keine zeitintensiven Probenvorbereitungsschritte nötig. Die (kohlensäurefreie) Softdrinkprobe wird direkt in das hier verwendete HPLC-System eingespritzt.

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Experimentelles
Nach dem Öffnen der Energy-Getränkedosen wird die Kohlensäure im Ultraschallbad ausgetrieben. Danach werden die Proben direkt ohne Filtrationsschritt in ein 1,5-ml-HPLC-Standardgläschen abgefüllt. Das Standard-Autosampler-Probenrack wird mittels der Hitachi-Maintenance-Software virtuell in zwei Bereiche aufgeteilt. In einen Bereich für die 1,5-ml-Standardvials für die Energydrink-Proben und einen Bereich für die 300-µl-„Fixed Insert“-Mikrovials. Zu jeder Energydrink-Probe im Standardvial muss ein Mikrovial für den Mischvorgang zugeordnet werden. In diesen Mikrovials erfolgt die automatische 1 : 20-Verdünnung der Energydrink-Proben. Spritzenvorsatzfilter sind nicht notwendig, da die Probe automatisch von dem Chromaster Autosampler verdünnt wird. Der HPLC-Autosampler pipettiert 10 µl einer Energydrink-Probe in dieses Mikrovial sowie 190 µl Autosampler-Waschlösung, die aus 50 % Acetonitril besteht. Durch mehrmaliges Ansaugen und Ausstoßen der Probelösung im Mikrovial wird die Lösung gemischt. Aus diesem Mischvial wird dann 20 µl verdünnte Probelösung angesaugt und in das HPLC-System eingespritzt.

Bild 1: Das System „VWR Hitachi Chromaster“ mit Lichtstreudetektor. © VWR International

Das verwendete HPLC-System (Bild 1) besteht aus einer Pumpe mit quaternärem Niederdruck-Gradientenzubehör sowie eingebautem 6-Kanal-Entgaser. Der Autosampler übernimmt die Probenverdünnung sowie die Injektion der verdünnten Probe auf die Säulen, die sich im Säulenofen befinden. Die Detektion der aufgetrennten Analyten erfolgt direkt mit Hilfe des Lichtstreu-Detektors „VWR ELSD 90“ (ELSD – Evaporative Light Scattering Detector). Komplettiert wird die Anlage durch den Organizer zur Aufnahme der HPLC-Lösungsmittelflaschen sowie das Interface-Controlboard und die OpenLab-HPLC-Steuer- und Auswertesoftware. Durch die automatische 1 : 20-Verdünnung der Probe vor der Injektion wird die Matrixbelastung der Säulen auf ein Minimum reduziert. Dies bewirkt eine lange Lebensdauer der drei HPLC-Säulen, die in Reihe geschaltet sind. Zuerst dient eine „Chromolith® RP-18 endcapped 5-4.6 mm (Merck)“-Vorsäule dazu, Restpartikel und Matrixbestandteile von den eigentlichen Trennsäulen fernzuhalten. Ein Merkmal dieser Vorsäule ist die hohe Porosität des Trägermaterials, so dass kaum Rückdruck erzeugt wird.

Als zweite Säule kommt eine „Sequant® ZIC™-HILIC 50-4.6 (3.5 µm), 200 Å (Merck)“ zum Einsatz, die es durch ihre Zwitterionenstruktur ermöglicht, das sehr polare Taurin im Chromatogramm so zu verzögern, dass es von den Zuckern getrennt wird und als letzter Peak im Chromatogramm eluiert (s.  Bild 2).

Bild 2: Chromatogramm des zuckerhaltigen HPLC-Standards. © VWR International

Als dritte Säule zur eigentlichen Trennung der Zucker wird die „Shodex Asahipak NH2P-40 3E“ in der Dimension 250-4.6 mm verwendet. Diese Säule (Basismaterial ist Polyvinylalkohol), ist in der hier verwendeten Aminomodifikation für die Trennung der Zucker verantwortlich. Vorteil dieser Säule ist, dass durch das Polymermaterial eine Hydrolyse der Aminogruppen vom Säulenmaterial durch den Wasseranteil im Eluenten, wie man es in der Regel bei kieselgelbasierten Aminosäulen findet, verhindert wird.

Zuckerhaltig oder zuckerfrei

Neben dem Taurin können auch die Hauptzucker Fruktose, Glukose, Saccharose und Laktose in den Energydrink-Proben bestimmt werden (s. Chromatogramm Bild 3).

Bild 3: Chromatogramm des zuckerhaltigen Energydrinks mit Acesulfam. © VWR International

Beim Betrachten des Overlays fiel ein Peak links von der Saccharose auf, der zunächst nicht zugeordnet werden konnte. Alle weiteren Zucker, die in Betracht kämen, wurden eingespritzt. Doch keinem dieser Zucker konnte der unbekannte Peak zugeordnet werden. Der Peak stellte sich schließlich als Acesulfam heraus, den man in einem zuckerhaltigen Energydrink nicht vermutet hätte, siehe hierzu auch das Overlay des Standards mit zwei zuckerhaltigen Energydrink-Proben (Bild 4).

Bild 4: Overlay von Standard mit zwei zuckerhaltigen Energydrink-Proben. © VWR International

Auch zuckerfreie Energy-Getränke (Light-Drinks) können mit der hier beschriebenen Methode untersucht werden werden. So kann neben dem Taurin im Light-Produkt auch der Zuckerersatzstoff Acesulfam nachgewiesen werden (Bild 5).

Bild 5: Overlay von Standard mit zwei Light-Energydrinks. © VWR International

Fazit aus den Untersuchungen

Aufgrund einer geringen Flussrate von 0,35 ml/min kann ein geringer Acetonitril-Verbrauch erzielt werden. Die geringe Flussrate und die gesamte Säulenlänge von mehr als 30 cm bedingt auf der anderen Seite eine relativ lange Gesamtlaufzeit des HPLC-Gradientenlaufes von 60 min, da die Säulen erst wieder gut mit den Anfangsbedingungen equilibriert werden müssen. Zusammenfassend kann man festhalten, dass die gezeigte Applikation Taurin in normalen zuckerhaltigen Energydrinks neben den Zuckern Fruktose, Glukose, Lactose und Saccharose sowie dem Zuckerersatzstoff Acesulfam direkt und ohne Derivatisierung trennen und detektieren kann. Eine Probenvorbereitung entfällt. Auch das Acesulfam und das Taurin in den Light-Energydinks können bestimmt werden.

AUTOR
Volker Eckert
HPLC Application Specialist
VWR International GmbH, Darmstadt
Tel. 06151-39 72 0
info.de@vwr.com
www.vwr.de
www.avantorsciences.com

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