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Dieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich?

HPLC-TippDieser Aktion folgt dieses Ergebnis – wieso eigentlich?

Schauen wir uns die im letzten HPLC-Tipp beschriebenen Fälle an:
Was beeinflusst Peakfläche und Retentionszeit?

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Elutionsreihenfolge

Peakfläche und konzentrationsabhängiger Detektor
1.
 Nehmen wir an, am Eingang zum Detektor tritt eine Leckage auf und ein Teil der Probe geht dadurch verloren. In diesem Fall nimmt zwar die Probenmasse (absolute Anzahl der Substanzmoleküle) in jenem Segment des Eluenten, in dem die Probe sich befindet, ab, die Konzentration aber (Anzahl der Substanzmoleküle pro Volumeneinheit) bleibt konstant. Das bedeutet also, die Peakfläche muss konstant bleiben – oder?

Das ist richtig, auch dann, wenn wir zwei mögliche Fälle betrachten:
a) Eine Leckage führt zu einer Abnahme des Flusses, z.B. um 20 %. Dadurch verweilen die Moleküle um 20 % länger in der Detektorzelle. Die Anzahl der Moleküle ist zwar durch die Leckage geringer geworden, aber jene geringere Anzahl absorbiert um 20 % länger UV-Licht, die Fläche bleibt konstant.

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b) Die Leckage führt zunächst zur Abnahme der Flussrate, der Druck nimmt ebenfalls ab. Manch eine Pumpe kann über eine eingebaute Korrektur den Fluss nun um jenen Betrag erhöhen, so dass der ursprünglich eingestellte Fluss wieder erreicht wird. Die Ausgangssituation ist erneut hergestellt worden, die Peakfläche bleibt somit also konstant.

2.  Wenn ich 10 µl injiziere, bekomme ich eine Peakfläche von beispielsweise 5000 Flächeneinheiten. Wenn ich nun 20 µl injiziere, injiziere ich zwar die doppelte Menge an Molekülen, diese Moleküle befinden sich aber in einem doppelten Volumen, die Konzentration bleibt dadurch konstant und damit müsste die Peakfläche auch konstant bleiben. Tut sie aber nicht – wieso nicht?

Das Volumen, in dem sich die Probenmoleküle befinden, ist das Peakvolumen (Fluss x Peakbreite). Wenn in beiden Fällen das Peakvolumen konstant bleibt (Beweis: Die Peakbreite bleibt konstant, somit liegt also keine Überladung vor), bedeutet dies gleichzeitig, dass sich in diesem konstant gebliebenen Peakvolumen die doppelte Anzahl an Molekülen befindet, die Konzentration nimmt um den Faktor 2 zu, die Peakfläche ebenso.

3. Ich injiziere 10 µl bei einem Fluss von 1 ml/min, und es ergibt sich eine Fläche von 10 000 Flächeneinheiten. Ich injiziere noch einmal diese 10 µl, diesmal bei 2 ml/min. Da ich ja 100 % das Gleiche injiziert habe, müsste die Peakfläche konstant bleiben - die Peakhöhe lassen wir im Moment außer Acht. Tut sie das wirklich, und wenn nicht, wieso nicht?

Im Prinzip der identische Fall wie unter 1: Wenn der Fluss sich ändert, ändert sich die Verweildauer der Moleküle in der Detektorzelle und somit die Zeit für die UV-Absorption. Der aktuelle Fluss beeinflusst somit die sich aktuell ergebende Peakfläche: Wenn der Fluss zunimmt, nimmt die Peakfläche ab und umgekehrt, es gilt: Fluss x Fläche = konstant – für einen konzentrationsabhängigen Detektor wie zum Beispiel einen DAD!

Retentionszeit in einem RP-System
1. Ich injiziere in einem RP-System polare Komponenten. Sie eluieren früh; wenn ich den wässrigen Anteil im Eluenten erhöhe, eluieren sie später. Wieso eigentlich? Was ist an folgender Argumentation falsch? Polare Analyten müssten sich im polarer gewordenen Eluenten eigentlich wohler fühlen („Ähnliches mit Ähnlichem“), sie würden vom Eluenten eher mitgenommen und müssten demnach später eluieren…

Jedes reale Molekül enthält mindestens ein Kohlenstoff-Atom plus „irgend-etwas“, somit ist jedes Molekül (bis auf das Oxoniumion H3O+) hydrophober als ein Wassermolekül. Das bedeutet, jede Substanz muss mit einem RP-Material eine stärkere Wechselwirkung als ein Wasser-Molekül eingehen – ob sie will oder nicht. Je mehr Wasser also der Eluent enthält (bis hin zu 100 % Wasser bei „AQ“-Phasen), umso intensiver wird die Substanz „komplimentiert“/gezwungen, mit der stationären Phase in stärkere Wechselwirkung zu treten und eluiert somit später.

2. Benzylamin ist eine starke Base; wieso eluiert eine derart polare Komponente an einer LiChrospher- oder an einer Zorbax-ODS-Säule (beide Materialien weisen eine starke Belegung mit C18-Alkylketten auf, folglich sind starke hydrophobe Wechselwirkungen möglich) später als eine hydrophobe, neutrale Komponente wie Toluol?

Vorbemerkung: Hydrophobe Wechselwirkungen sind nicht so stark wie polare Wechselwirkungen. Eine starke Base (also eine recht polare Komponente) kann mit polaren Gruppierungen an der stationären Phase wie Restsilanole starke Wechselwirkungen eingehen. Und solche Restsilanole – die in diesem Fall sogar dissoziiert vorliegen und somit ganz schön „aggressiv“ sind – gibt es bei diesen älteren Materialien wie „Sand am Meer“. Ein größeres „Glück“ für eine Base ist kaum vorstellbar, sie bleibt also sehr gerne dort und eluiert (wenn überhaupt…) sehr spät.

3. Ich injiziere meine Probe und erhöhe – nach dem Erhalt einer (passablen) Trennung – anschließend den Acetonitril-Anteil im Eluenten. Doch dies führt dazu, dass einige Peaks auf einmal koeluieren, ihre Elutionreihenfolge ändern oder urplötzlich ein Tailing aufweisen. Wieso kann dieser, eigentlich „harmlose“ Schritt solch drastische Folgen haben?

Eine Erhöhung des Acetonitril-Anteils bedeutet eine Erhöhung der Elutionskraft der mobilen Phase; die Peaks eluieren somit früher. Soweit so gut – nur: Diese Beschleunigung ist im Falle von unterschiedlichen Substanzen nicht für alle Substanzen gleich, einige Peaks marschieren schneller nach vorne, einige langsamer. Das Ergebnis lautet: Es sind alle möglichen Variationen denkbar.

Derartige Beispiele gibt es viele, ich zeige Ihnen in der nebenstehenden Abbildung (Bild 1) eines: Hier wird der lnk-Wert (k = relative Retentionszeit) von drei unterschiedlichen Substanzen in Abhängigkeit von % Acetonitril in der mobilen Phase dargestellt.

Es ergibt sich je nach Eluentenzusammensetzung folgende Elutionsreihenfolge der Komponenten:
Bei 30 % ACN: 1, 2, 3.
Bei 40 % ACN: 1, Koelution 2 und 3.
Bei 70 % ACN: Koelution 1 und 2, 3.
Bei 90 % ACN: 2, 1, 3.

Wenn schließlich ein Peak plötzlich ein auffallendes Tailing zeigt, könnte der Grund mit einer Veränderung des pH-Wertes nach der Zugabe/Veränderung des organischen Anteils im Eluenten zusammenhängen (siehe auch HPLC-Tipp).

Ihr Stavros Kromidas

© by Stavros Kromidas
http://www.kromidas.de

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Dr. Stavros Kromidas

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