HPLC-Tipp

Die kleinen HPLC-Tipps

Nachdem der August teilweise gelinde gesagt „verregnet“ war, verlängern wir kurzerhand den Sommer und definieren den September einfach als einen weiteren Sommermonat. Die Konsequenz ist, dass wir uns auch dieses Mal mit mehreren kleinen Tipps beschäftigen wollen. Heute geht es um folgende drei Themen:

Tabelle 1

1: Wann ergibt sich welcher Druck?
Bei einer Änderung der Dimensionierung von Säulen bzw. Kapillaren sowie der Teilchengröße ändert sich der Druck. Nahezu alle Hersteller bieten EXCEL-Makros an, mit deren Hilfe der sich ergebende Druck bei einer Änderung der oben genannten Parameter rechnerisch ermittelt wird. Dennoch möchte ich hier gerne anhand einiger Zahlenbeispiele auf ein, zwei Umstände hinweisen, um anschließend zu einem Resultat zu kommen.

Merke: Der Druck verhält sich mit der Säulenlänge linear, mit dem Innendurchmesser der Säule sowie dem Teilchendurchmesser quadratisch und mit dem Innendurchmesser einer Kapillare in der vierten Potenz. Das heißt: Bei einer Verdoppelung der Säulenlänge nimmt der Druck um den Faktor 2 zu. Bei einer Verringerung des Innendurchmessers der Säule bzw. der Teilchengröße um den Faktor 2 nimmt der Druck um den Faktor 4 zu. Und bei einer Verringerung des Kapillar-Innendurchmessers um den Faktor 2 nimmt der Druck um den Faktor 16 zu.

In der Tabelle 1 ist für einen fiktiven Fall der jeweils neue Wert für den Druck angegeben, der sich bei der Änderung des entsprechenden Parameters im Vergleich zum Ausgangsdruck von 150 bar ergibt. Wir unterstellen ferner, dass bei 150 bar Ausgangsdruck ein Druckbeitrag von ca. 0,7 bar durch eine 0,25-mm-Verbindungskapillare verursacht wird. In der Tabelle hat sich in jeder Zeile nur die angegebene Zahl gegenüber den Ausgangsbedingungen geändert, der Rest bleibt konstant.

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Bemerkungen:

Bild 1
  • Eine Verringerung des Säulen- oder des Teilchendurchmessers bringt Vorteile mit sich, etwa eine Verbesserung der Massenempfindlichkeit und eine Verringerung des Lösungsmittelverbrauchs. Beides ist mit einem modernen Gerät problemlos möglich; 600 bar wäre ein Druck, bei dem keine nennenswerten apparativen Probleme erwartet werden.
  • Anspruchsvolle isokratische Trennungen bedingen kleine Totvolumina. Hier werden dünne Kapillaren benötigt und dies ist nur unter „echten“ UHPLC-Bedingungen realisierbar. Damit sind hohe Arbeitsdrücke gemeint, denn: Eine dünne Kapillare macht eher als eine dünne Säule bzw. feinkörniges Material den Einsatz einer UHPLC-Anlage notwendig. Im hiesigen Beispiel ergäbe sich durch eine dünne Säule (2 statt 4 mm) oder ein feinkörniges Material (2,5 statt 5 µm) und der dann notwendigen dünnen Kapillare ein Druck von ca. 1184 bar (600 bar [wg. der Säule bzw. der Korngröße] + 584 bar [wg. der Kapillare]). Wird eine um den Faktor 2 kürzere Kapillare verwendet – was zweifelsohne sinnvoll wäre –, ergäbe sich ein Druck von immerhin 892 bar: 600 + 292. Selbstverständlich wird in der UHPLC bei einem wesentlich geringeren Fluss als in der HPLC gearbeitet. Auch werden viel kürzere Säulen verwendet – beides mildert die Druckproblematik: Dennoch halten wir als Fazit fest: Unter anspruchsvollen UHPLC-Bedingungen wird der Beitrag des Kapillar-Innendurchmessers zum resultierenden Druck verhältnismäßig dominanter im Vergleich zum Säulen-Innendurchmesser und der Teilchengröße.

Im November-Tipp werden wir uns mit der Frage beschäftigen, wie Druck vernünftig genutzt werden kann.

2: Peak mit „Fuß“
Wenn an einem eigentlich symmetrischen Peak an der hinteren Flanke eine Störung in Form eines Aufsetzers auftaucht oder das Peak-Ende sich sehr lange nach hinten hinzieht, etwa so wie im Bild 1, dann denken Sie bitte an folgende zwei mögliche Ursachen:

1. Wenn die Injektionsnadel nach dem Aufziehen auf eine mechanische Barriere stößt (zum Beispiel „Sandwich“-Septum), wird quasi zweimal injiziert, die zweite Substanzzone kann die erste kaum mehr „aufholen“.

Bild 2: Zur Beladbarkeit von voll-porösen und Fused-Core-Materialien (Details siehe Text).

2. Wenn eine Säule etwas länger offen stehen gelassen wird, trocknet das Packmaterial am Säulenkopf etwas aus und eine plötzliche Flusserhöhung kann ein winziges Totvolumen hervorrufen. Auch hier wandert die Probe bis zum Detektor quasi in zwei Substanzzonen.

3: Fused-Core-Materialien
Fused-Core-Materialien ermöglichen schnelle Trennungen bei guter Effizienz (Bodenzahl) und geringen Drücken. Soweit so gut. Aufgrund der Oberflächenarchitektur jedoch (auf Details kann ich hier leider nicht eingehen) sind viele kommerzielle Materialien im Falle eines großen Konzentrationsunterschieds Haupt-/Nebenkomponente, größerer Injektionsvolumina bzw. „schwieriger“ Matrix im Vergleich zu voll-porösen Teilchen schneller überladen. Dies wird selbst von den Herstellern – jedenfalls häufig – eingeräumt.

Im Bild 2 wird ein Beispiel der Firma Waters gezeigt: Die Beladbarkeit des voll-porösen CSH-Materials ist bei gleicher Säulendimensionierung im Vergleich zu zwei Fused-Core-Materialien eindeutig besser.


Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken
www.kromidas.de

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