UHPLC

Monolithische Säulen für UHPLC-Trennungen

An die HPLC-Analytik werden immer höhere Anforderungen, besonders in Bezug auf Auflösung, Leistung und Empfindlichkeit, gestellt. Diese können mit der inzwischen etablierten UHPLC unter Verwendung kleiner Partikel und kurzer Säulen mit geringem Innendurchmesser sehr gut erfüllt werden.

Diese Methode kann Zeit sparen, wenn die zu analysierenden Proben recht sauber sind. Matrix-reiche Proben, wie Lebensmittel, Körperflüssigkeiten, Kosmetika oder auch pharmazeutische Formulierungen wie Cremes, Sirup oder Gels, stellen in UHPLC-Anwendungen jedoch eine besondere Herausforderung dar. Säulen, die mit kleinen Partikeln gefüllt sind, um eine hohe Trennleistung zu erreichen, können sehr schnell verstopfen, wenn die aufgegebene Probe noch zu viele Matrixanteile enthält. In diesem Fall muss die Probe vor der Trennung von der Matrix befreit werden, um ein Verstopfen der Säule zu verhindern.

Bild 1: Analytik von Matrix-reichen Proben mit HPLC und UHPLC unter Verwendung von Sub-2-µm-Partikeln und monolithischen Säulen. © Merck

Bild 1 zeigt ein typisches Beispiel für die Problematik beim Wechsel von HPLC zu UHPLC für Matrix-reiche Proben. Bei der HPLC wurde eine 5-µm-HPLC-Säule zur Trennung eingesetzt. Die Laufzeit betrug hier 15 Minuten, und es wurde eine Filtration der Probe (Dauer: 2 min.) vor der Trennung durchgeführt. Die Standzeit der Säule war bei dieser Anwendung etwa 7 000 Injektionen. Bei Einsatz von UHPLC mit einer Sub-2-µm-Säule konnte die Trennung auf zwei Minuten verkürzt werden. Allerdings reduzierte sich die Säulenstandzeit mit vorhergehender Probenvorbereitung (Filtration) der Probe auf weniger als 100 Injektionen. Um die Standzeit der Säule zu erhöhen und ein Verstopfen der Säule durch verbleibende Matrix zu vermeiden, musste der UHPLC-Trennung eine Festphasen-Extraktion (SPE) vorgeschaltet werden. Damit dauerte die Analyse der Probe mit UHPLC etwa genauso lang wie zuvor mit der HPLC. Im Gegensatz zu partikulären Säulen machen monolithische Säulen – aufgrund ihres Aufbaus – eine schnelle Trennung mit vereinfachter Probenvorbereitung möglich.

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Bild 2: Bi-modulare Porenstruktur monolithischer Silica-Säulen (Chromolith®). © Merck

Monolithische Säulen

Monolithische Säulen benötigen keine Fritten, da sie aus einem einzigen Silica-Stab mit einer bimodularen Porenstruktur bestehen. Die Mesoporen von Chromolith®-Säulen haben eine Porenweite von 13 nm bzw. 130 Å, für „Chromolith® HighResolution (HR)“-Säulen sind es 150 Å, die Makroporen haben eine Porengröße von 2 µm, 1,5 µm oder 1,15 µm je nach monolithischer Phase (Bild 2). Die Säulen sind aufgrund der Porenstruktur besonders robust, langlebig und können Matrix aus der Probe gut tolerieren, was aufwendigere Probenvorbereitung zum Schutz der Säule größtenteils unnötig macht. Die großen Makroporen der monolithischen Säulen reduzieren den Rückdruck der Säule signifikant. Dadurch sind höhere Flussraten und damit schnellere Trennungen als auch eine breitere Auswahl von mobilen Phasen möglich. So können auch höher viskose Lösungsmittel eingesetzt werden, die z. B. bessere Löslichkeit der Zielanalyten oder Probenmatrix aufweisen. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, durch Säulenkopplung sehr lange Säulen zu verwenden, um die Trennleistung zu erhöhen und komplexe Proben mit vielen Analyten trennen zu können. Für die Verwendung in UHPLC-Systemen eignen sich besonders Säulen mit geringem Innendurchmesser.

Bild 3: UHPLC-Trennung von Profen mit den Säulen Chromolith HR RP-18e2mm I.D. und FPP (fully porous particle) C18 1,7µm. © Merck

Trennungen mit verschiedenen Säulenarten

Für die Analyse von fünf Profenen (Bild 3) wurden verschiedene Säulenarten für die Trennung unter UHPLC-Bedingungen eingesetzt. Die eingesetzte monolithische Säule weist einen deutlich geringeren Säulenrückdruck im Vergleich zu einer Sub-2-µm-FPP (fully porous particle)-Säule auf. Chromolith-Säulen sind in einer Reihe von Selektivitäten für optimierte Methodenentwicklung verfügbar. Chromolith-WP-300-Säulen sind mit einer Mesoporenweite von 300 Å für die Trennung von Biomolekülen geeignet.

Bild 4: UHPLC-Trennung von Antikörper-Fragmenten (LC: Light Chain; HC: Heavy Chain) mit FPP und Chromolith® WP 300-Säulen (Bedingungen: Säulenlänge: 10 cm; MP: [A] Wasser (0,1 % TFA); [B] Acetonitril (0,08 % TFA); Gradient: 20 % B 1 min. auf 45 % B in 9 min.; Temp.: 80 °C; Flussrate: 0,38 ml/min; Det.: UV 220 nm; Probe: DTT Digest (mAb Fragmente LC/HC), „SILu™Lite SigmaMAb“ (MSQC4), 2 mg/ml). © Merck

Bild 4 zeigt die Analytik von Antikörper-Fragmenten auf einer 1,7-µm-FPP- bzw. monolithischen WP-300-Säule mit RP-18 (C18)-Modifizierung und Innendurchmessern von 2,1 bzw. 2 mm I.D. unter Verwendung eines UHPLC-Systems. Die chromatographische Performance beider Säulen ist vergleichbar bei deutlich geringerem Rückdruck für die monolithische Säule.

Zusätzlich zu RP-18 sind auch Protein-A-Säulen für die Affinitäts-Chromatographie und eine Epoxy Phase, die eine Immobilisierung unterschiedlichen Liganden durch den Anwender erlaubt, verfügbar. Mit der Chromolith® WP 300 Epoxy Phase kann auf einfache Weise eine individuelle und auf die Applikation abgestimmte Selektivität im eigenen Labor hergestellt werden.

Zusammenfassung

Monolithische Säulen zeigen eine hohe Matrix-Toleranz, eine sehr hohe Robustheit und geringen Rückdruck, was die UHPLC-Analytik deutlich effizienter macht.

AUTORIN
Petra Lewits
Global Product Manager Analytical HPLC Columns
Merck KGaA, Darmstadt
www.sigmaaldrich.com/HPLC

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