Zukunftsperspektiven der UHPLC

Immer besser durch noch kleiner?

Die HPLC ist eine etablierte und ausgereifte Trenntechnik, für die eine erfolgreiche Weiterentwicklung zur Ultra-Hochdruckflüssigkeitschromatographie erreicht wurde. Sind weitere Drucksteigerungen so einfach möglich oder können noch höhere Leistungsniveaus nur mit neuen Ansätzen erreicht werden?
© Sophie/stock.adobe.com

Der größte Fortschritt in den letzten Jahrzehnten der Flüssigkeitschromatographie war wohl die erfolgreiche Markteinführung der Ultra High Pressure Liquid Chromatography (UHPLC). Sie war auf der Seite der LC-Hardware die logische Weiterentwicklung in Richtung Drucksteigerung und hat damit die Verkleinerung der Trennpartikel ermöglicht bzw. wurde durch die gesteigerten Anforderungen der Sub-2-Micron-Säulen vorangetrieben. Letztlich hat genau diese Kombination wesentlich schnellere bzw. höher aufgelöste Chromatogramme in die LC-Routine gebracht.

Wie viel Druck ist machbar?

Wenn die Zukunftsperspektive für die Verbesserung der Auflösungen und der Peakkapazitäten an einer weiteren Verkleinerung der porösen Trennpartikel hängt, dann muss eine wesentliche Erhöhung des Druckes in der UHPLC in Kauf genommen werden und technisch realisierbar sein.

Praktisch alle Experten sind sich einig, dass eine weitere Verkleinerung von Partikeln unter 1 µm mit derzeit kaum lösbaren Problemen verbunden ist. Zum einen sind Drücke von 3000 – 5000 bar erforderlich, die äußerst hohe Anforderungen an die Herstellung entsprechend robuster und sicherer Geräte erfordern. Wenn die Partikelgröße z. B. von 1,5 µm auf 0,5 µm reduziert werden soll und gleichzeitig die Säulenlänge um den Faktor 3 verkürzt wird, bedeutet das einen Anstieg des Rückdrucks um den Faktor 9. Dafür sind mehrere 1000 bar System-Druck erforderlich, die auch die mechanische Stabilität der Packung sehr belastet. Dazu kommt eine deutliche Erhöhung der Reibungshitze innerhalb der Säule, die zu einem Temperaturgradienten von zumindest 20 °C führen dürfte, wodurch wiederum mit Trennleistungs-Verlusten zu rechnen ist. Außerdem zeigt eine Berechnung von Agilent Technologies, dass sich bei einer Reduktion der Partikelgröße von 5 auf 0,5 µm zwar die Effizienz 10-fach steigern lässt, die Druckdifferenz aber auf das Tausendfache steigt (Bild 1).

Anzeige

Andererseits können hohe Temperaturen, durch ihren günstigen Einfluss auf die Viskosität der Flüssigkeit, den Druck in der UHPLC verringern. Im Gegensatz zur zusätzlich entstehenden Reibungswärme muss diese aber homogen verteilt sein und die höhere thermische Belastung darf die Analyten nicht schädigen.

Bild 1: Druck und Effizienz bei abnehmenden Partikelgrößen (schematisch). ­ © Wolfgang Brodacz

Die konventionelle HPLC erreicht mit 5 µm Partikeln und 400 bar Vordruck (bei 30 °C) z. B. rund 10 000 theoretische Trennstufen. Die Hochtemperatur-UHPLC (HT-UHPLC) kommt hingegen mit Sub-2-Micron-Partikel bei 1 000 bar auf 30 000 theoretische Böden, und das in einem Drittel der Zeit. Dafür sind allerdings Temperaturen um 100 °C notwendig, was die Zielanalyten erst einmal aushalten müssen. Rein theoretisch ergeben sich aus kinetischen Kurvenverläufen eine Verdreifachung der Effizienz und eine Drittelung der Analysenzeit, wenn Partikelgrößen unter 1 µm zur Anwendung kommen und Drücke von 5 000 bar möglich sind. Dafür müsste die Temperatur aber noch weiter auf 150 °C gesteigert werden.

Aus all dem darf geschlossen werden, dass es sehr schwierig sein wird, deutlich unter die 1-µm-Partikelgröße zu gehen. Zusätzlich können die mit solchen Säulen erzielbaren sehr hohen Auflösungen nur genutzt werden, wenn die Systemdispersion in der gesamten UHPLC-Anlage um rund eine Größenordnung reduziert werden kann. Allein schon die Säulenanschluss-Hardware und die Fritten für die winzigen Partikel sind besondere herstellungstechnische Herausforderungen. Einige Experten befürchten bei einer weiteren deutlichen Erhöhung des Druckes und des Flusses, dass es zu Verlusten bei der Robustheit kommt und in der Praxis zusätzliche Gefahren entstehen könnten.

Höhere Trenn-Effizienz erreichen

Im Bestreben nach Reduktion des Gegendrucks hat man sich auch die Oberfläche von Golfbällen zum Vorbild genommen. Die kleinen Dellen im Golfball, auch Dimples genannt, verringern den Luftwiderstand. Dadurch fliegt er bis zu viermal weiter als ein Ball mit glatter Oberfläche. Eine golfballähnliche Partikel-Morphologie bewirkt, dass der umströmende Eluent dahinter kleinere Wirbelzonen bildet und mit dem günstigeren Strömungsprofil auch weniger Gegendruck in der Säule entsteht. Die aufgerauten Partikel vergrößern darüber hinaus bei nichtporösen Teilchen auch die chromatographische Interaktionsfläche.

Im wahrsten Sinn des Wortes etwas Druck aus der Problematik nehmen kann die Supercritical Fluid Chromatography (SFC). Die SFC, die gerade wieder eine Renaissance erfährt, verwendet Fluide (wie CO2) in einem überkritischen Zustand. Bei Kohlendioxid bedeutet das Bedingungen von über 31 °C und mehr als 74 bar. Die mobile Phase hat dabei, einfach ausgedrückt, die Eigenschaften eines Gases und einer Flüssigkeit. Das überkritische Fluid befindet sich bei einer so hohen Temperatur, dass man es durch keinen noch so hohen Druck wieder in den rein flüssigen Aggregatzustand überführen könnte. Man komprimiert es wie ein Gas und stellt so über den Druck die Dichte ein. Die Dichte kann aber auch erhöht werden, indem bei konstantem Druck die Temperatur abgesenkt wird.

In der überkritischen Fluidchromatographie können dadurch Partikel unter 1,7 µm und längere Säulen als bei der klassischen LC eingesetzt und damit effizientere Trennungen erfolgen. Am Ende der Säule hat die SFC bei Kopplung mit der Massenspektrometrie noch den Vorteil, dass das CO2 nahezu „von selbst verschwindet“.

Technische Aspekte einer Trennbeschleunigung

Wenn die Hochdruckproblematik technisch zufriedenstellend gelöst werden kann und es z. B. durch SFC oder spezielle strömungstechnisch günstige Monolith-Konstruktionen gelingt, den Fluss zu erhöhen, wären noch wesentlich schnellere Trennungen realisierbar. Mit dieser Beschleunigung der Trennung tauchen aber auch neue Herausforderungen für die Hardware-Hersteller auf. Eine starke Verkürzung der Analysenzeit verlangt dem gesamten Umfeld, vor und nach der Säule, dieselbe Beschleunigung ab. Allein der Autosampler benötigt i. d. R. im Durchschnitt 1 bis 2 Minuten für die Bereitstellung, Spülung, Vorbereitung und Durchführung der Probenaufgabe. Autosampler, die alternierend in zwei idente Säulen injizieren (s. Bild 2), können jetzt schon Overhead-Zeiten (Probenbearbeitung; Wasch- und Equilibrierzeiten etc.) durch parallele Chromatographie produktiv nutzen. Mehrere parallele Sampler in Multiplexing-Konfiguration könnten die Produktivität noch weiter steigern.

Bild 2: Multiplexing mit zwei parallelen Flusslinien (bei identen LC-Säulen) zur besseren Nutzung eines Massenspektrometers durch überlappende Laufzeiten. © Shimadzu

Ebenso müssen die Abtastraten der Detektoren und die gesamte Datenverarbeitungs-Geschwindigkeit entsprechend gesteigert werden. Bei modernen optischen Detektoren stehen schon Datenraten von 100 – 300 Hz zur Verfügung und eine Steigerung wäre ebenso wie die IT-Beschleunigung möglich. In der Massenspektrometrie (kurz MS) sind die technischen Hürden schon wesentlich höher.

Massenspektrometrie und Trennsäulen

Da die meisten Substanzen in irgendeiner Form ionisierbar sind, kann das Massenspektrometer im Prinzip als universell einsetzbarer LC-Detektor verstanden werden. Trotz mannigfacher Anstrengungen hinsichtlich Vereinfachung sind Massenspektrometer, und umso mehr die Tandem-MS, nicht nur deutlich anspruchsvoller in der Optimierung, sie sind auch wesentlich kostspieliger in der Anschaffung und im Betrieb als klassische LC-Detektoren. Sie bieten zwar sehr gute Identifizierungsmöglichkeiten, sind aber anfällig für quantifizierungsstörende Matrixeffekte bei der Ionisierung.

Einer der wichtigsten Fortschritte im Zusammenspiel zwischen Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie war die Entwicklung der Ionisationstechniken bei Atmosphärendruck. Die größte Durchschlagskraft hat dabei die Elektrospray-Ionisation ESI in fast allen Bereichen der LC-MS(MS)-Analytik bewiesen. Damit wurde die Verknüpfung der (U)HPLC mit der MS revolutioniert. Von sehr vielen Experten wird die Schaffung dieser höchst erfolgreichen Schnittstelle als wichtigste Entwicklung der letzten Jahrzehnte der Trenntechniken beurteilt. Die Verbreitung der MS wird nichts von ihrer Dynamik verlieren, die Massenspektrometrie wird sich wohl trotz Komplexität breitflächig in der LC-Routineanalytik durchsetzen.

Das wird auch Auswirkungen auf den Säulenmarkt haben, denn im Gegensatz zu optischen Detektoren kann das Massenspektrometer das Säulenbluten bei hoher Sensitivität sehr wohl „sehen“, was störend sein kann. So wie in der GC-MS(MS) wird auch in der LC-MS(MS) ein Bedarf für neuartige sog. „Low-bleed“-LC-Säulen zugunsten geringeren Untergrundrauschens und höherer Stabilität bei der MS-Detektion entstehen. Besonders für die Elektrospray-Ionisation sind Säulen, die weniger Puffer erfordern, um gute Peakformen zu erhalten, besonders erwünscht. Denn gerade die Belastung mit Salzen oder Puffern verschlechtert die Sensitivität des Massenspektrometers und trägt zu Matrixeffekten bei der Ionisierung bei.

So wie derzeit in der GC bereits verfügbar, ist es aus der Sicht der Anwender mehr als wünschenswert, wenn es auch in der „normalen“ Routine-LC moderne Anschluss-Systeme nach dem Prinzip „Plug and Play“ geben würde. Zugunsten einer flexibleren Systemnutzung soll damit ein Säulenwechsel, im Sinne von „Click and Run“, auch für Ungeübte schneller und zuverlässiger begünstigt werden. Eine zuverlässige, selbstarretierende und verriegelnde Schnittstelle wäre Voraussetzung für den nächsten Schritt: der automatisierte Säulenwechsel bzw. der regelmäßige Austausch von Einwegvorsäulen, der durch ein sog. Add-on-Robotik-Modul vollzogen werden könnte.

Vermutlich werden zukünftig moderne 3D-Druckverfahren helfen, neue Verbindungen zu entwickeln und neue Säulenformate zu kreieren, die mit höherer Effizienz und mehr Robustheit eine anwenderfreundlichere Installationsprozedur ermöglichen.

Anmerkung von Autorenseite: Dieser Artikel und die getroffenen Aussagen beruhen auf den Meinungen, Statements, Interview-Beiträgen etc. von einigen international anerkannten LC-Experten. Zusammengefasst und mit der Erfahrung von fast 40 Jahren Chromatographie interpretiert spiegeln die Einschätzungen auch die Ansicht des Autors wider.

AUTOR
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit
Lebensmittelsicherheit Linz

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige