Säulen im Vergleich

Analytik von Chinolizidinalkaloiden in Süßlupinen

Die Autoren berichten über die Bestimmung von Chinolizidinalkaloiden in Süßlupinen mit Hilfe der HPLC und stellen ihre Ergebnisse aus der Methodenentwicklung mit drei verschiedenen Säulen gegenüber.
© madcat13shumbrat/Shutterstock.com

Lupinen (Bild) sind eine Pflanzengattung in der Unterfamilie der Schmetterlingsblütler (Faboideae) innerhalb der Familie der Hülsenfrüchtler (Fabaceae oder Leguminosae). Entsprechend sind sie als eine hervorragende Proteinquelle (ca. 40 - 50 %) bekannt und v. a. für Vegetarier und Veganer interessant. Der Proteingehalt der Lupinen ist mit dem der Sojabohnen vergleichbar, allerdings weisen Lupinensamen deutlich weniger Fett (< 10 %) als Sojabohnen (ca. 20 %) auf. Sie sind dafür reicher an Ballaststoffen (15 % - 20 %). Innerhalb mehrerer Lupinenarten, ist hauptsächlich die Blaue Lupine (Lupinus angustifolius, narrow leafed lupin) interessant, deren Weiterzüchtung stabile alkaloidarme Sorten von Süßlupinen hervorgebracht hat. 

Tabelle 1: Chinolizidinalkaloidvorkommen in den verschiedenen Süßlupinen. (xx - Hauptalkaloid: Gehalte zwischen 0,001 % - 0,01 %; x - Nebenalkaloid: Gehalte zwischen 0,0001 % (1 mg/kg) - 0,001 %. Quelle: PiCA

Für eine Verwertung von Lupinen im Futtermittel- und Lebensmittel-Bereich werden Grenzwerte im Gesamtalkaloid-Gehalt von maximal 0,05 % bzw. 0,02 % angestrebt [1, 2]. Dies ist nur bei Süßlupinenvarietäten wie in Tabelle 1 möglich. Innerhalb der unterschiedlichen blauen Süßlupinsamen kann sowohl Lupanin als auch Angustifolin das Hauptalkaloid darstellen; in sehr seltenen Fällen kann es auch 13-Hydroxylupanin sein [2]. Die Alkaloidbildung bzw. Verteilung ist hauptsächlich genetisch bedingt [2].

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Methoden

Es sind viele unterschiedliche Methoden zur Bestimmung von Chinolizidinalkaloiden (kurz: CA) beschrieben worden [3, 4]: TLC, GLC, HPLC (FLD), Gravimetrie, Kolorimetrie als frühe Methoden und immunologische Methoden wie RIA, ELISA, SPA. Modernere Methoden basieren meistens auf der GC-(MS)-Bestimmung [5] der nach der sauren wässrigen Extraktion gewonnenen Extrakte, welche in einem weiteren Schritt ins Basische und anschließend ins unpolar Organische (Dichlormethan, Hexan u. Ä.) gebracht werden. Zusätzliche Aufreinigungsschritte wie SPE sind ebenfalls beschrieben worden [3, 5, 7].

Bestimmung mittels HPLC

Erstaunlicherweise gibt es nur wenige HPLC-Ansätze, mit der Detektion via MS/MS [6, 7] oder DAD [8], obwohl gerade die Extraktion im wässrigen Sauren in allen Literaturstellen beschrieben wird [2 - 8]. Da die protonierten CA eine sehr hohe Polarität sowie eine hohe Wasserlöslichkeit aufweisen, sind sie für die Analyse mittels HPLC bestens geeignet.

Es gibt einen Ansatz, beschrieben von Kolper und Kollegen von der BfR [8], welcher die LC-MS/MS-Bestimmung beschreibt. Allerdings fehlt in der Methode eines der wichtigsten Chinolizidinalkaloide des blauen Süßlupins: Angustifolin. Die Probenaufarbeitung basiert, wie bereits für die GC-MS-Messung beschrieben, auf einem pH-Wechsel ins Basische mit einer anschließenden Probenaufreinigung mittels Umlösung ins Unpolare [8].

Damit keine möglichen Verluste z. B. beim pH- oder Polaritätswechsel entstehen, basiert unsere Methode lediglich auf der anerkannten sauren Extraktion [3]. Da in Lupinen die Gehalte an CA im höheren ppm-Bereich liegen und die MS/MS (ESI+) sehr empfindliche Signale liefert, können die wässrigen, sauren Extrakte, lediglich verdünnt, auf einer geeigneten HPLC-Säule getrennt und anschließend direkt selektiv und empfindlich mit Tandem-MS detektiert werden.

Tabelle 2: Chinolizidinalkaloide und deren Bestimmungsgrenzen inkl. Retentionszeitenvergleich (vergleichbare Eluentenprofile). Die verwendeten ­Säulen sind in Klammern angegeben. Quelle: PiCA

Bei der Methodenentwicklung wurden mehrere UHPLC-Säulen ausprobiert. Als Messsystem wurde das Gerät „Infinity 1290 II-UHPLC – MS/MS 6500 QTRAP“ genutzt. Retentionszeiten der verschiedenen CA auf unterschiedlichen Säulen sind in Tabelle 2 aufgeführt. Alle Säulen liefern eine solide Analytik für die Messung der wichtigsten CA in unterschiedlichen Produkten. Die Vorteile/Nachteile der Säulen bei unseren Methodencharakteristika sind in der Tabelle 3 zusammengefasst. Die ausgewählten Parameter der Validierung sind in Tabelle 4 zusammengefasst.

Tabelle 3: Säulenvergleich. Quelle: PiCA

Mit unseren Methoden untersuchen wir bei Pica alle Rohstoffmaterialien der Firma Prolupin, welche für die Herstellung von Lebensmitteln aus den blauen Süßlupinensamen verwendet werden und verifizieren somit die Rohstoff-Konformität. Außer Rohstoffen werden die einzelnen Zwischenprodukte untersucht, welche die erfolgreiche Entfernung der CA während der Produktion sichern [11], mit dem Ergebnis, dass die Endprodukte zum Schluss nur sehr kleine bis keine Spuren von CA aufweisen.

Fazit

Tabelle 4: Validierungsdaten des Systems mit Säule Zorbax, Testmaterial: lupinfreies Sojamehl. Quelle: PiCA

Alle drei Säulen eignen sich sehr gut für die Messung der ausgewählten CA mit dem Hinblick auf den unterschiedlichen Fokus der Analytik.

Literatur/Referenzen:

[1] Risikobewertung des Alkaloidvorkommens in Lupinensamen, Stellungnahme 003/2017 des BfR vom 27. März 2017 DOI 10.17590/20170327-102936

[2] K. Fischer und Kollegen, LupiBreed - Erhöhung der Ertragsstabilität und Ertragsleistung der Süßlupine zur Sicherung der einheimischen Eiweißversorgung, Projekt FKZ: 14EPS009, Julius Kühn-Institut (JKI) Institut für Züchtungsforschung an landwirtschaftlichen Kulturen, www.orgprints.org/32887

[3] Wink, M., Methoden zum Nachweis von Lupinen-Alkaloiden. In: „Lupinen 1991-Forschung, Anbau und Verwertung“ (M. Wink, ed.), 78-90, 1992

[4] EFSA Journal, Scientiic opinion on the risks for animal and human health related to the presence of quinolizidine alkaloids in feed and food, in particular in lupins and lupin-derived product, EFSA Journal 2019;17(11): www.efsa.europa.eu/efsajournal

[5] D. Resta et al., Evaluation of total quinolizidine alkaloids contentin lupin flours, lupin-based ingredients, and foods, Mol.Nutr.FoodRes.2008,52,490–495, DOI10.1002/mnfr.20070020

[6] S. L. Otterbac et al., Quinolizidine alkaloids are transported to seeds of bitter narrow-leafed lupin, Downloaded from https://academic.oup.com/jxb/advance-article-abstract/doi/10.1093/jxb/erz334/5536687, 27 July 2019

[7] A. Petruczynik, Analysis of alkaloids from different chemical groups by different liquid chromatography methods, Cent. Eur. J. Chem., 10(3), 2012, 802-835; DOI: 10.2478/s11532-012-0037-y

[8] F. Kolrep et al., Entwicklung eines Analyseverfahrens zur Bestimmungvon Chinolizidinalkaloiden in Lupinen mit LC-MS/MS, Posterpräsentation

[9] C. Reinwaldt, M. Bittner, G. Kempe, T. Glauner, Quantitation of Pyrrolizidine Alkaloids in Honey and Herbal Teas by UHPLC-MS/MS, Helth and veterinary Research institute, Saxony, Agilent Technologies, Jan. 16 2017

[10] BfR Methode: Bestimmung von PA in Pflanzenmaterial mittels SPE-LC-MS/MS, Prüfvorschrift-BfRPA_TEE-2.0/2014

[11] www.prolupin.de/herstellung

AUTOREN

A. Romanotto, J. Langner, M. Sander
PiCA Prüfinstitut Chemische Analytik GmbH, Berlin
www.pica-berlin.de

S. Duhr
ProLupin GmbH, Grimmen
www.prolupin.de

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