HPLC-Tipp

Unterschiede in den HPLC-Anlagen - die Peakfläche

Der Fall:
Dass Geräte von unterschiedlichen Herstellern große Unterschiede aufweisen können, ist eine HPLC-Binsenweisheit. Der Unterschied kann im Verweilvolumen bei Gradientenanlagen liegen (Hochdruck vs. Niederdruck), in der Richtigkeit bei der Wellenlängeneinstellung (z.B. ±2 nm vs. ±4 nm), im Material der Nadel im Probengeber (z.B. Stahl vs. Messing) und damit verbunden evtl. Memoryeffekte, in der unterschiedlichen Geometrie der Mischkammer oder der Detektorzelle bei u.U. identischem Volumen und, und… Diese Unterschiede sowie die Folgen sind erfahrenen AnwenderInnen bekannt: Unterschiede in der Retentionszeit, in der Peakfläche und in der Peakform.

Heute möchte ich gerne auf zwei Sachen hinweisen, an die vielleicht nicht immer gedacht wird, dazu folgender Fall: Seit langem vergleichen Sie Ergebnisse aus zwei unterschiedlichen Anlagen (zwei unterschiedliche Hersteller), es gab bis dato keine Probleme. Seit kurzem wird an beiden Geräten eine Methode mit einem 50 % Puffer/50 % MeOH-Eluenten gefahren und Sie finden an einem Gerät eine um 5 % geringere Peakfläche im Vergleich zum anderen. Beide Anlagen sind selbstverständlich qualifiziert und beide werden regelmäßig geprüft. Was ist hier das Problem?

Die Lösung
Noch einmal: Es wird unterstellt, dass beide Geräte technisch in Ordnung sind. Eine mögliche Erklärung für vorliegenden Fall wäre folgende: Es kann sein, dass die eine Pumpe trotz Qualifizierung, bei dieser Eluentenzusammensetzung einen falschen Fluss liefert und somit ergibt sich eine andere Fläche: Jene Pumpe wird bei dieser Viskosität mit der Kompressibilität der zwei zu mischenden Eluenten einfach nicht „fertig“: Es ist so, dass moderne Geräte mit Hilfe einer Korrekturfunktion – die die unterschiedliche Viskosität der Lösungsmittel berücksichtigt – in der Lage sind, trotz der evtl. unterschiedlichen Viskositäten der zwei Lösungsmittel stets den eingestellten Fluss zu liefern. Nur: Einige Geräte können es gut und andere weniger gut. Wir haben folgendes ausprobiert, um die Flussrichtigkeit der Pumpen von zwei bekannten Herstellern bei unterschiedlichen Eluentenzusammensetzungen zu testen (1 ml/min, Messzylinder, Stoppuhr):

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Fall 1: Test mit Wasser, beide Geräte A und B: Einwandfrei.

Fall 2: Test mit 50 % MeOH/50 % Wasser: Gerät A okay, Gerät B: 0,95 ml/min.

Eine Flussdifferenz von 5 % bei dieser Mischung führt zu einer Differenz bei der Peakfläche von ebenfalls 5 %. Diese Problematik macht sich häufig bei Hochdruckgradienten und MeOH/Wasser-Eluenten bei Mischverhältnissen um 40…50 % bemerkbar (Viskositätsmaximum von MeOH/Wasser-Mischungen). Man könnte sich nun folgenden „Worst Case“ vorstellen: Peaks, die bei einer Zusammensetzung von ca. 50 % MeOH/50 % Wasser oder Puffer eluieren, zeigen evtl. eine andere – und falsche – Fläche im Vergleich zu Peaks, die an einer anderen Anlage gemessen werden (die es vielleicht bei dieser Mischung „besser“ kann, s. weiter oben), während Peaks, die bei niedrigeren oder höheren % MeOH eluieren, keine Probleme bereiten, die Peakflächen an beiden Geräten sind vergleichbar – und man versteht die Welt nicht mehr. Noch einmal: Die (aktuelle) Flussrichtigkeit kann von der aktuellen Viskosität des Eluenten abhängig sein.

Kurz noch ein weiterer Punkt: Wir haben festgestellt – ohne dies quantitativ belegt zu haben –, dass die Flussrichtigkeit bei unterschiedlichen Pumpen auch vom Gegendruck abhängig ist: Manch eine Pumpe fördert auch bei niedrigen Drücken richtig und präzise, manche Pumpe braucht einen Gegendruck von mindestens 40…50 bar, um eine zufriedenstellende Flusskonstanz zu gewährleisten.


Das Fazit
Verlassen Sie sich nicht immer blind auf die Ergebnisse bei der Gerätequalifizierung, denn die Testbedingungen dort sind in der Regel anders als Ihre aktuellen chromatographischen Bedingungen. Überprüfen Sie bei Bedarf selbst die Flussrichtigkeit – und auch die Präzision – bei Ihrer aktuellen Eluentenzusammensetzung (s. in diesem Zusammenhang auch HPLC-Tipp im September: Vk und Einstellparameter).

© by Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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