HPLC-Tipp

Der HPLC-Tipp

Wie kann die Qualität von HPLC-Wasser überprüft werden und wie macht sie sich in der HPLC bemerkbar?
Von Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall
Üblicherweise wird in der HPLC entweder vor Ort aufbereitetes Wasser (z.B. Milli Q, PURELAB Ultra usw.) oder gekauftes „HPLC“- oder gar „Spektroskopie-Wasser“ verwendet. Solche Wässer weisen eine Leitfähigkeit um die 18 MΩ/cm (ca. 0,05 µS/cm) und einen TOC-Gehalt von ca. 5…10 ppb, oft sogar < 5 ppb auf. Im Zuge von Sparmaßnahmen oder aus organisatorischen Gründen wird immer wieder die Notwendigkeit für die Verwendung von „HPLC-Qualität“-Wasser in Frage gestellt. Ich werde immer wieder gefragt, ob denn vielleicht auch doppelt-destilliertes oder einfach entionisiertes oder sonstiges „sauberes“ Wasser verwendet werden kann und ob ein solches die HPLC-Analytik tatsächlich merklich beeinträchtigt. Statt unnötige, zeit- und nervenaufreibende „Glaubens“-Diskussionen zu führen, sollte nach meinem Dafürhalten dies einfach überprüft werden. Das geht relativ schnell und man hätte den Beweis schwarz auf weiß.

Die Lösung
Die Überprüfung besteht üblicherweise aus 2 Schritten: Erstens wäre die Frage zu klären, „ist ein Qualitätsunterschied festzustellen“, und zweitens, „beeiträchtigt ein solcher das chromatographische Verhalten der aktuellen Säule-Eluent-Kombination bzw. meine Analytik?“

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Bild 2: TOC-Test zur Überprüfung der HPLC-Wasser-Qualität, Details siehe Text.

Zur ersten Frage:

Ein möglicher Qualitätsunterschied besteht zum einen im unterschiedlichen TOC-Gehalt und zum anderen in der unterschiedlichen Salzkonzentration, widerspiegelt in einer unterschiedlichen Leitfähigkeit.

Überprüfung:

Man spült 50…100 ml des bis dato verwendeten Wassers über eine C18-Vorsäule oder eine kurze Säule, dreht jene anschließend um und injiziert zum einen ca. 10 µl einer KNO3-Lösung und zum anderen ca. 100 µl ACN oder THF bei 210…215 nm. Die gleiche Prozedur wird mit dem Alternativ-Wasser wiederholt. Wenn nun eine vermeintlich unterschiedliche Salzkonzentration im Wasser einen Einfluss haben sollte, dann eher auf das chromatographische Verhalten von polaren oder gar inerten Komponenten wie z.B. KNO3. Eine unterschiedliche Konzentration an organischen Verunreinigungen dagegen kann leicht durch deren Aufkonzentrierung auf der Oberfläche eines hydrophoben Materials und anschließende Elution mit Hilfe eines starken Lösungsmittels (ACN oder THF) festgestellt werden.

In Bild 1 und 2 sind die Ergebnisse nach einem solchen Experiment dargestellt. Sie wurden freundlicherweise von Frau Carmen Hartmann und Jessica Gruber, Fa Grünenthal, Aachen, zur Verfügung gestellt.

Bild 1 zeigt die Injektion von KNO3 nach dem Spülen einer 70 mm C18-Säule mit HPLC-Wasser (unteres Bild) und nach dem Spülen mit einem Alternativ-Wasser, das eine 100-fache höhere Leitfähigkeit aufweist (oberes Bild). Wie zu erwarten, beeinflusst die unterschiedliche Salzkonzentration („Pufferstärke“) die Retentionszeit und bei bestimmten polaren Analyten sicherlich auch die Peakform.
Bild 2 gibt das Ergebnis des TOC-Experimentes wieder: Die untere Kurve ergibt sich bei der Elution mit ACN bei 214 nm nach dem Spülen der Säule mit HPLC-Wasser, die obere nach dem Spülen mit dem Alternativ-Wasser, welches einen 5-fach höheren TOC-Gehalt aufweist.

Zur zweiten Frage:

Wenn Sie nicht im Spurenbereich tätig sind, kann es sein, dass eventuell vorhandene Qualitätsunterschiede, wie weiter oben beschrieben, im Alltag sich kaum bemerkbar machen. Sogar folgendes kann passieren: „Sehr“ sauberes Wasser könnte die Reproduzierbarkeit negativ beeinträchtigen, weil jenes aus „allen“ Oberflächen, mit denen es in Berührung kommt, Ionen/Verunreinigungen herauslösen kann. Deswegen gilt zu überprüfen, ob eventuell vorhandene Qualitätsunterschiede Ihre aktuelle Applikation tatsächlich beeinträchtigen oder eben nicht.

Überprüfung:

Sie spülen Ihre übliche Säule bei Ihren üblichen Bedingungen über Nacht, in dem Sie den Eluenten einmal mit dem HPLC-Wasser ansetzen und einmal mit dem Alternativ-Wasser. Am jeweils nächsten Morgen injizieren Sie bei den üblichen Trennbedingungen Ihre Probe - sicherlich realitätsnäher als lediglich eine Standardlösung zu injizieren. Ist eine Differenz in der Retentionszeit und Peakform festzustellen?

Das Fazit

Eine Vor-Ort-Überprüfung der Qualität von Wasser aus HPLC-Sicht ist relativ einfach. Es gilt im Falle von Qualitätsunterschieden zu klären, ob solche die aktuelle Trennung beeinträchtigen oder nicht. In diesem Zusammenhang sollte bei der Entscheidungsfindung vor allem an die Anwendung der Methode in der Routine gedacht werden, z. B. Methodentransfer steht an, Umzug in ein anderes Labor/Gebäude geplant, LC-MS-Applikation, längerfristige Lieferverträge, Kundenanforderungen usw.

© by Stavros Kromidas

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