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HPLC-TippSystemeignungstest - Sinn und Kriterien

Der Fall

Der Systemeignungstest ("System Suitability Test", SST) ist ein wichtiges, sensibles Thema speziell im regulierten Umfeld. Ein Blick in die Alltagspraxis zeigt, dass bzgl. SST unterschiedliche Auffassungen betreffend Sinn, Häufigkeit und Kriterien vorherrschen. In diesem Tipp möchte ich dazu einige Hinweise und Anregungen geben.

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Die Lösung

Zunächst ein paar Worte zum Sinn eines SST. Halten wir zunächst Folgendes fest: In den Monographien steht "expressis verbis", dass ein derartiger Test die Apparatur, die Proben, die Methode und die "electronics" (sprich: Datenerfassung und -verarbeitung, d.h. einschließlich Reportdaten wie Peakfläche) umfassen soll. Das bedeutet: Ziel eines SST ist die Überprüfung des Gesamtsystems - oder anders formuliert: Es geht beim SST letztlich um die Überprüfung, ob diese Methode "hier und jetzt" an diesem Gerät nach vorgegebenen Kriterien funktioniert. Diese Prüfung muss also die reale Situation wiedergeben. Das heißt: Für den SST sollte u.a. eine reale Probe verwendet werden, also eine Probe, die bzgl. Konstitution, Konzentration, Matrix, etc. exakt den Proben entspricht, die anschließend vermessen werden. Die häufige Praxis, für den SST eine Standardlösung zu verwenden, ist nur dann statthaft, wenn im Rahmen der Validierung bewiesen worden ist, dass die Matrix das (quantitative) Ergebnis nicht (signifikant - Kriterien?!) beeinflusst. Ansonsten bleibt im Verborgenen, ob und wenn ja, in welchem Ausmaß die Matrix bei der späteren Messung der Proben - Matrix z.B. selbst UV-aktiv, viskos, pH-Wert verändernd, usw. - sowohl Peakform als auch Retentionszeit und/oder Peakfläche beeinflusst. Sollte letzteres der Fall sein, reduziert sich der "SST" mit einer Standardlösung zu einem Gerätetest.

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Eine weitere, immer wichtiger werdende Bedeutung eines SST: In den Monographien steht folgender Hinweis: Bei etwaigen gewollten/notwendig gewordenen Veränderungen einer Monographie-Methode (Säulendimensionen, stationäre Phase, chromatographische Bedingungen) besteht kein Revalidierungsbedarf, solange die SST-Kriterien weiterhin erfüllt werden. Denn gerade die Ergebnisse eines SST mit einer realen Probe zeigen ja, ob "alles"OK ist, ob also die vorgenommene Änderung die "Qualität" der Trennung gemäß den festgelegten Kriterien negativ beeinflusst oder eben nicht. Beispiel: Wenn ich eine kürzere Säule verwende, den Fluss entsprechend anpasse und ich weiterhin R ≥2 beim kritischen Peakpaar erreiche, ist alles bestens. Probleme entstehen nur, wenn ich falsche Kriterien festlege. Die Konsequenz: Richtig durchgeführte SST (reale Probe plus Praxisbedingungen) und geeignete, gut durchdachte SST-Kriterien schaffen Spielräume und bringen Zeitersparnis.

Nun zu den Kriterien

Die Ziele einer quantitativen HPLC-Methode sind in der Regel folgende: Ausreichend gute Trennung (Kriterium: Auflösung), quantitative Bestimmung der Hauptkomponente(n) (Kriterium: Peakfläche), quantitative Bestimmung von Nebenkomponenten/Verunreinigungen (Kriterium: Peakfläche bei der Bestimmungsgrenze) sowie Identifizierung von Komponenten (Kriterium im hiesigen Zusammenhang: Retentionszeit). Diesen Zielsetzungen zufolge könnten für einen SST die in der untenstehenden Tabelle aufgelisteten Kriterien infrage kommen.

HPLC-Fragestellungen und mögliche SST-Kriterien; Details, s. Text.

Analytisches Ziel Geeignete chrom. Größe Mögliches Kriterium Kommentar
Trennung Auflösung R ≥ 1
R ≥ 1,5
R ≥ 2
Ca. 5 % Peaküberlappung
Basislinientrennung
Auch bei Tailing und unterschiedlichen Peakgrößen beträgt der Integrations-
fehler < ca. 1%
Gehaltsbestimmung
Hauptkomponente(n)
Peakfläche Δ: ca. 2...3 %
(6-fache, unabhängige Bestimmungen)
Dies scheint ein vernünftiges Kriterium z.B. beim Methodentransfer zu sein
(wg. z. B. Δ Detektoren)
Gehaltsbestimmung von Spuren bzw. von Nebenkomponenten Peakfläche Δ: ca. 10 %
(6-fache, unabhängige Bestimmungen)
Stark von der Konzentration, der Matrix, der Detektion, etc. abhängig, auch
15...20 % könnten zweckdienlich sein
Identitätstest Retentionszeit ca. 5...10 % abs.
oder: k ≈ 2 %
Stark von der Methode abhängig
Erfassung von Spuren bzw.
Nebenkomponenten
Bestimmungsgrenze Peak/Rauschen-
Verhältnis, 50 : 1,
evtl. 80 : 1
Nur ab einem S/N-Verhältnis von
ca. > 50 : 1 beträgt der Integrationsfehler < ca. 1%

Einige Kommentare

Auflösung: Ist die Peakform aufgrund der Methode nicht ideal und/oder die Peaks divergieren in ihrer Größe um den Faktor 10 oder mehr, erscheint das Kriterium R ≥ 2 sinnvoll - wohl bemerkt: R ≥ 2. Die Forderung R ≥ 3 oder ≥ 4 ist nur in seltenen Fällen dienlich/notwendig, denn sie ist einfach zu streng.

Bestimmungsgrenze: Bei dem häufig verwendeten Kriterium von Peak/Rauschen- Verhaltnis 10 : 1 sollte man sich folgendes bewusst machen: Bei keiner Auswertesoftware auf dem Markt ist der Integrationsfehler kleiner mindestens ca. 10 %. Ferner ist der Variationskoeffizient abhängig von Einstellparametern wie Sample Rate, Zeitkonstante und Bandbreite. Vorschlag: Je sechs Injektionen aus einem Vial und Bestimmung vom VK bei S/N 10 : 1 und bei 50 : 1 bei unterschiedlichen Einstellparametern. Nur so haben Sie "Schwarz auf Weis" wenigstens den Einfluss von Einstellparametern auf die Reproduzierbarkeit der Fläche abhängig von S/N-Ratio - der absolute Fehler ist naturlich eine andere Sache.

Nebenbei: Möglicherweise werden Sie bei nicht-optimaler Trennung und/oder Peakform feststellen, dass der VK der Peakfläche größer ist als der der Peakhöhe. Wahrscheinlich werden Sie dennoch bei der Peakfläche bleiben, in einigen Jahren wird man womöglich etwas offener mit dieser Tatsache umgehen ...

Eine letzte Bemerkung als Wiederholung bevor wir zum Fazit kommen: SST-Kriterien beschreiben das, was eine Methode für eine konkrete Fragestellung können muss. Wenn Sie etwas ändern müssen (damit eben diese Kriterien eingehalten werden) oder möchten (damit Sie z.B. Zeit sparen) und diese Kriterien nach wie vor Bestand haben, besteht kein Revalidierungs- oder sonstiger Handlungsbedarf. In den Monographien wird dies nicht lediglich erlaubt - es wird ausdrücklich darauf hingewiesen.

Das Fazit

  • Mach' Dir den Einfluss der Matrix auf Deine SST-Kriterien bewusst und verwende nur dort, wo möglich, für den SST eine Standardlösung.
  • Lege bewusst SST-Kriterien abhängig von der Fragestellung fest; überlege z.B., ob Bodenzahlen und Tailingfaktoren aussagekräftige Kriterien sind, denn: In der Auflösung steckt "alles" drin, es kann nicht sein, dass die Bodenzahl oder der Tailingfaktor derart dramatisch abnehmen, ohne dass sich dies in der Auflösung bemerkbar macht. Und: Das was zählt, ist der VK bei der Bestimmungsgrenze und nicht, ob der Tailingfaktor 1,3 oder 1,2 beträgt.
  • Hinterfrage kritisch das Kriterium S/N von 10 : 1 als Bestimmungsgrenze - vor allem bei nicht-optimalen Peaks - und überprüfe den Einfluss von Einstellparametern auf den VK. Dies dürfte besonders dann sinnvoll sein, wenn ein Methodentransfer ins Haus steht. Damit zusammenhängend: Nenne zu den von Dir formulierten SST-Kriterien auch die Einstellparameter, bei denen diese Kriterien ermittelt wurden bzw. gelten - der spätere Routineanwender wird es Dir danken.


Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

www.kromidas.de

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