PCR – irgendwann ein alter Hut?

Isotherme Nukleinsäureamplifikation für eine gerätefreie Bakteriendiagnostik

Mit der isothermen Nukleinsäureamplifikation eröffnen sich neue Möglichkeiten für die gerätefreie Bakteriendiagnostik. 

Vor-Ort-Detek­tion eines bakteriellen Krankheitserregers unter Verwendung der iso­thermen Nukleinsäureampli­fikation. Das Testergebnis kann mit bloßem Auge anhand einer farbigen Bande ausgelesen werden. Es können mehrere Pathogene gleichzeitig aus einer Probe detektiert werden. © Fraunhofer IZI-BB

In jüngerer Zeit wurden zahlreiche isotherme Verfahren für die Vervielfältigung von Nukleinsäuren etabliert. Diese verzichten auf die typischen Thermozyklen der Polymerasekettenreaktion (PCR). Dies mag trivial klingen, bietet jedoch neue Wege einer schnellen und sensitiven Pathogendetektion – gerade im Bereich Point-of-care-Testing – und damit eine mögliche Alternative zur klassischen PCR.

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) zählt zu den wichtigsten Methoden der modernen Molekularbiologie und spielt auch in der Diagnostik eine wesentliche Rolle. Aufgrund der Komplexität in der Durchführung hat die PCR aber einige Nachteile. Als Alternative und Vereinfachung bieten sich isotherme Amplifikationsmethoden an. Diesen Methoden ist eines gemein: Sie laufen auf einer gleichbleibenden Reaktionstemperatur ab. Die typischen Temperaturzyklen einer klassischen PCR entfallen. Vorteile wie eine hohe Sensitivität, Spezifität und Geschwindigkeit der Methode bleiben aber erhalten.

Komplexer wird es jedoch, wenn man die inzwischen sehr zahlreichen Methoden der isothermen Nukleinsäureamplifikation in der Gesamtheit erfassen will. Die Ansätze dazu, wie eine Vervielfältigung der DNA erzielt wird, sind unterschiedlich, basieren jedoch grundsätzlich auf der Adaption natürlicher Prozesse wie beispielsweise DNA-Reparaturmechanismen, der homologen genetischen Rekombination oder der Replikation viraler oder bakterieller DNA/RNA. Aus diesem Grund werden in der Reaktion häufig z. B. ein oder mehrere Enzyme zusätzlich zu einer Polymerase eingesetzt oder auch eine besondere Struktur der Primer – der kurzen genspezifischen Oligonukleotide, welche als Startpunkt für die DNA-Synthese dienen – verwendet. In der PCR wird ein thermostabiles Enzym genutzt, welches die Denaturierungstemperatur für die Trennung der doppelsträngigen DNA übersteht. Bei isothermen Verfahren wird meist eine Polymerase mit hoher strangverdrängender Aktivität eingesetzt, da keine thermische Separation des Doppelstranges erfolgt [1]. Das Resultat ist jedoch dasselbe: Ein einzelnes spezifisches DNA-Molekül wird in kurzer Zeit millionenfach vermehrt und kann dann nachgewiesen werden.

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Was können isotherme Verfahren schon?

Die PCR ist mit einem wesentlichen Geräteaufwand verbunden. Auch wird aufgrund der komplexen Probenvorbereitung und Durchführung geschultes Personal benötigt. Grundsätzlich bleibt die PCR also eine Labor-basierte Methode. Der Verzicht auf die zyklische Wiederholung schneller und präziser Temperaturwechsel mag sich nach einer nur unwesentlichen Veränderung anhören, macht aber spezialisierte Geräte wie den Thermocycler für die isotherme Nukleinsäureamplifikation überflüssig. Die Anforderung an die Gerätegrundausstattung wird ebenfalls wesentlich reduziert, so kann die isotherme Reaktion beispielsweise einfach auf einem Heizblock oder im Wasserbad durchgeführt werden.

Parallele Detektion von Pathogenen in einem Mikrofluidiksystem. Die isotherme Amplifikation läuft an mit Microarray-Technologie gedruckten genspezifischen Spots direkt über den Chip ab. Das Ansteigen des Fluoreszenzsignals kann ortsaufgelöst ausgewertet werden. Hier: die Detektion von Salmonella en­terica. © Fraunhofer-IZI-BB

Aber nicht nur das – auch für die Integration in sogenannte Lab-on-a-Chip-Systeme bieten sich isotherme Amplifikationsverfahren an. Diese mikrofluidischen Systeme vereinen die Funktionalität eines gesamten Labors auf einem kleinen Chip und bieten sich für die Vor-Ort-Diagnostik außerhalb eines Zentrallabors, beispielsweise in Arztpraxen, an. Dadurch dass nur eine gleichbleibende Temperatur für die Amplifikation gehalten werden muss, können ein wesentlich einfacheres Design sowie kostengünstigere Materialen verwendet werden. Auch treten Probleme, welche mit dem raschen Temperaturwechsel assoziiert sind, in der miniaturisierten Mikrofluidik und bei den geringen Flüssigkeitsmengen im System wesentlich seltener auf [2].

Ein wesentlicher Vorteil und Potenzial der neuen Amplifikationsmethoden besteht aber in der Erweiterung des Anwendungsspektrums und der Detektionsmöglichkeiten im Vergleich zur klassischen PCR. So sind bereits unzählige Ausleseverfahren in der Literatur beschrieben und etabliert. Eine Amplifikationsreaktion kann beispielsweise mit Hilfe von kolorimetrischen Verfahren oder einer Trübungsbestimmung (Turbidimetrie) mit dem bloßen Auge beurteilt werden. Dies macht solche Systeme zu echten Vor-Ort-Testsystemen und reicht für die direkte Bewertung am Ort des Geschehens aus.

Natürlich sind auch die gängigen Methoden mit interkalierenden Farbstoffen wie bei der PCR verwendbar. Aber auch hier gibt es Weiterentwicklungen, die zu weiteren innovativen Fluoreszenzindikatoren bzw. Sondensystemen geführt haben. Nicht zuletzt sind auch elektrochemische Detektionsformate und die Detektion des Amplifikationsproduktes auf Teststreifen interessant [3]. Bei letzterem erfolgt die Auswertung des Tests ähnlich wie bei einem Schwangerschafts- oder Blutzuckertest.

Gerätefreie Bakteriendiagnostik 

In unserem Labor wurde die Verwendung mehrerer isothermer Nukleinsäureamplifikationsmethoden erprobt und Tests für pro- und eukaryotische Krankheitserreger etabliert. Ein Ziel ist es, den kompletten Ablauf der Diagnostik so zu reduzieren, dass im besten Fall kein Laborgerät mehr benötigt wird, um ein Pathogen sensitiv und spezifisch nachzuweisen.

Anhand einer Methode soll im Folgenden gezeigt werden, dass gerätefreie Bakteriendiagnostik durchaus greifbar nahe ist. Hierzu wurde die sogenannte Rekombinase-Polymerase-Amplifikation, kurz RPA, verwendet. Bei dieser Technologie bindet ein Primer-Rekombinase-Komplex an komplementäre Sequenzen innerhalb der Ziel-DNA. Die exponenzielle Amplifikation einer Zielsequenz wird im Zusammenspiel mit diesem Primer-Rekombinase-Komplex und einer Polymerase erreicht. In der Reaktion werden nur zwei Primer und die beiden Enzyme verwendet. Ähnlich wie bei der PCR resultiert dies in einem Amplifikationsprodukt mit einer spezifischen Größe.

Durch eine Erweiterung der Reaktion um ein Oligonukleotid-Sondensystem ist die direkte Analyse auf einem simplen und kostengünstigen Teststreifen möglich. Ein separater Markierungsschritt ist nicht erforderlich. Sämtliche Schritte laufen in einem Reaktionsgefäß ab. Das Vorhandensein oder die Abwesenheit eines Krankheitserregers kann mit dem bloßen Auge anhand einer farbigen Bande analog zu einem immunchromatografischen Teststreifen bestimmt werden. Ein Ergebnis liegt nach unter 15 Minuten Reaktionszeit vor. Die Geschwindigkeit ist vergleichbar mit klassischen Vor-Ort-Schnelltests – auch hier will der Anwender nicht lange auf das Resultat eines Tests warten. Ein wesentlicher Vorteil ist jedoch die Sensitivität. In unseren Versuchen konnten Nachweisgrenzen von unter zehn koloniebildenden Einheiten z. B. von Legionella pneumophila erzielt werden [4].

Die RPA läuft bei konstanten Temperaturen knapp über der Körperwärme ab. Schon durch simples Wärmen des Reaktionsgefäßes in der Hand kann man einen sensitiven und spezifischen diagnostischen Test ablaufen lassen und so komplett auf diagnostische Instrumente verzichten. Die Amplifikation der Ziel-DNA findet auch bei Raumtemperatur statt. Allerdings mit verminderter Geschwindigkeit beziehungsweise geringerer diagnostischer Sensitivität. Ein Multiplexing ist mit der Methode ebenfalls möglich. Dabei werden mehrere Zielsequenzen gleichzeitig vervielfältigt. Dies ermöglicht die simultane Detektion mehrerer Pathogene oder die Integration einer Reaktionskontrolle [5].

Isotherme Verfahren als Alternative zur PCR?

Das Potenzial der isothermen Amplifikationsmethoden ist vorhanden. Für den breiten Einsatz in der Vor-Ort-Diagnostik sind aber weitere Schritte erforderlich. Durch die Neuartigkeit und die Vielfalt der innovativen Methoden fehlt es noch an der klinischen Validierung und Zertifizierung der Testsysteme. In Entwicklungsländern wird die sogenannte „Loop-Mediated Isothermal Amplification“ (LAMP) aufgrund ihrer Einfachheit und kostengünstigen Anwendung jedoch vielfach schon eingesetzt. In Forschungsbereichen außerhalb des diagnostischen Feldes werden isotherme Nukleinsäureamplifikationsmethoden für die Sequenzierung oder andere biosensorische Anwendungen bereits verwendet.

Im klinischen Bereich scheuen sich auch heute noch immer viele Anwender vor den Kosten der PCR. Diese liegen bei den isothermen Verfahren in einem ähnlichen Bereich oder zumindest nicht wesentlich niedriger. Hier kommen auch noch unklare Patentstrukturen hinzu, was die Entwicklung von diagnostischen Tests für Endanwender verkompliziert. Weitere Nachteile sind ähnlich wie bei der PCR. So besteht eine erhöhte Kontaminationsgefahr, weil nach der Amplifikation Millionen neue Startmoleküle für eine erneute Amplifikation entstehen. Auch ist der Aufschluss der Probe ein häufig vernachlässigter Bestandteil des diagnostischen Tests. Wir konnten aber bereits zeigen, dass viele isotherme Methoden in verschiedenen Probenmatrices wesentlich stabiler gegenüber potenziell inhibitorischen Substanzen sind als die PCR [6]. Daraus kann man schließen, dass nur eine minimale Probenaufreinigung erfolgen muss, was den Aufwand eines diagnostischen Tests auch wesentlich reduziert.

Dennoch überwiegen die Vorteile des minimalen Geräteaufwandes, der Flexibilität und der diagnostischen Effizienz und Geschwindigkeit. Auch wenn die PCR nicht vollständig abgelöst werden wird, so haben isotherme Amplifikationsmethoden gerade als Point-of-care-Test mit kleinen mobilen Geräten ihren Anwendungsbereich. Typische Gebiete sind die patientennahe Schnelldiagnostik, Lebensmittel- und Trinkwassersicherheit sowie die Veterinärmedizin, bei denen ein schnelles und direktes Resultat benötigt wird.

Fazit

An Alternativen zur PCR und innovativen Detektionstechnologien mangelt es nicht und das Potenzial der isothermen Nukleinsäureamplifikation ist bei weitem noch nicht ausgereizt. Stetig werden die Verfahren verbessert und erweitert. Vielfach ist noch Überzeugungsarbeit bei möglichen Endanwendern zu leisten. Es könnten aber neue diagnostische Potenziale erschlossen werden z. B. durch die „Umwidmung“ von bereits vorhandenen Geräten, welche bisher nicht für die Nukleinsäureanalytik in Betracht gezogen worden sind. Auch sind neue diagnostische Wege denkbar: Unter gleichen Reaktionsbedingungen können auch DNA und RNA vervielfältigt werden. Durch die sanften Reaktionsbedingungen ist die Analyse und Detektion von Protein- oder Enzymaktivität und Nukleinsäuren in einem Testsystem möglich. Hier eröffnen sich viele Anwendungsmöglichkeiten.

Literatur:

[1] Zhao Y, Chen F, Li Q, Wang L, Fan C: Isothermal Amplification of Nucleic Acids. Chem Rev 2015; 115: 12491 – 12545.

[2] Asiello PJ, Baeumner AJ: Miniaturized isothermal nucleic acid amplification, a review. Lab Chip 2011; 11: 1420 – 1430.

[3] Zhang X, Lowe SB, Gooding JJ: Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP). Biosens Bioelectron 2014; 61: 491 – 499.

[4] Kersting S, Rausch V, Bier FF, Nickisch-Rosenegk M von: A recombinase polymerase amplification assay for the diagnosis of atypical pneumonia. Anal Biochem 2018; 550: 54 – 60.

[5] Kersting S, Rausch V, Bier FF, Nickisch-­Rosenegk M von: Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens. Mikrochim Acta 2014; 181: 1715 – 1723.

[6] Kersting S, Rausch V, Bier FF, Nickisch-­Rosenegk M von: Rapid detection of Plasmodium falciparum with isothermal recombinase polymerase amplification and lateral flow analysis. Malar J 2014; 13: 99.

AUTOREN

Dr. Sebastian Kersting
Dr. Eva Ehrentreich-Förster
Dr. Markus von Nickisch-Rosenegk
Fraunhofer-Institut für Zelltherapie und Immunologie
Institutsteil Bioanalytik und Bioprozesse IZI-BB, Potsdam

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