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Geniom RT Analyzer PlattformMikrofluidische Biochips zur Identifizierung von miRNA-Biomarker-Signaturen

Dr. Julia Lange*)

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Geniom RT Analyzer Plattform: Mikrofluidische Biochips  zur Identifizierung von  miRNA-Biomarker-Signaturen
  1. febit holding gmbh, Im Neuenheimer Feld 519, 69120 Heidelberg. E-Mail: info@febit.com.


Biomarker gewinnen in der modernen Medizin zunehmend an Bedeutung. Vor allem Biomarkeranalysen auf Genom- und Transkriptionsebene erlauben dank innovativer Technologien, wie mikrofluidischer Microarrays, eine frühzeitige Diagnostik, Prognose sowie Risikoeinschätzung und können somit helfen, Patienten rechtzeitig und zuverlässig zu klassifizieren.

microRNAs (miRNAs), eine Klasse kleiner, nicht-proteinkodierender RNAs, und ihrer deregulierten Expression wird eine Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von Krankheiten wie Krebs zugesprochen. Aufgrund ihrer offensichtlichen Rolle in der Pathogenese verschiedenster Erkrankungen sowie der Möglichkeit, Expressionsänderungen mit Krankheitsstadien zu assoziieren, eignen sich miRNAs als wertvolle diagnostische Biomarker.

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In aktuellen Studien mit der Microarray-Technologie von febit wurde gezeigt, dass miRNA-Biomarker-Analysen auf Grundlage minimal-invasiv zugänglichen Probenmaterials wie Blut oder anderer Körperflüssigkeiten möglich sind und einen vielversprechenden Ansatz für diagnostische Biomarker-Tests darstellen. miRNA-Expressionsanalysen mittels etablierter mikrofluidischer Biochips dienen hierbei der Entwicklung von Biomarker-Signaturen für eine akkurate Patienten-Klassifikation. Die Biomarker-basierte Patientenuntersuchung und Risikoerfassung kann entscheidend zur frühzeitigen Detektion und spezifischen Diagnose von Krebs oder anderen Erkrankungen beitragen. Damit kann krankheitsübergreifend ein neuer Standard in der Diagnostik, bei Verlaufbeobachtungen und Prognose etabliert werden.

Biomarker

Laut dem amerikanischen National Institute of Health (NIH) sind Biomarker gekennzeichnet durch eine Eigenschaft, die objektiv gemessen und evaluiert werden kann und als Indikator für normale oder pathogene biologische Prozesse oder für pharmakologische Reaktionen auf therapeutische Interventionen dient. Diagnostische Biomarker ermöglichen es, die Erkrankung eines Patienten genauer zu definieren, während prognostische Biomarker Aussagen über die voraussichtlichen Heilungschancen und den Krankheitsverlauf erlauben. Prädiktive Biomarker hingegen zeigen die Wahrscheinlichkeit an, zukünftig an einer Krankheit zu erkranken, oder ermöglichen Aussagen über das voraussichtliche Ansprechen auf eine bestimmte Therapie und erleichtern damit die Auswahl der individuell besten Behandlung. Die Grenzen sind hier fließend und z.B. genomische oder RNA-Biomarker können gleich mehreren Kategorien zugeordnet werden.

Sowohl die genaue Klassifikation einer Erkrankung als auch die Auswahl der optimalen Behandlung gewinnen angesichts einer immer stärker individualisierten Therapie enorme Bedeutung. Viele neue und sehr spezifische Biomarker werden besonders in der Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen verwendet und sind dort bereits fester Bestandteil individualisierter Behandlungsstrategien.

microRNAs

microRNAs (miRNAs) sind eine Klasse kleiner, nicht-proteinkodierender RNAs, die mehr und mehr an Bedeutung in der biomedizinischen Forschung gewinnen. Sie spielen eine entscheidende Rolle in der Genregulation, indem sie sequenzspezifisch an ihre Ziel-mRNAs (messenger RNA) binden und entweder eine Translationsrepression oder eine mRNA-Degradation bewirken.

Gegenwärtig konzentrieren sich viele Forschungsfelder auf die Expression und die Funktion der unterschiedlichen miRNAs. Ein einzelnes miRNA-Molekül kann die Aktivität mehrerer unterschiedlicher Gene regulieren, während umgekehrt ein einzelnes Gen von vielen unterschiedlichen miRNAs gesteuert werden kann. miRNAs und ihre Interaktionen in genregulatorischen Netzwerken sind unerlässlich für normale Entwicklungs- und Differenzierungsprozesse in gesundem Gewebe. Entsprechend kann eine Deregulation von miRNAs die Entstehung und den Verlauf von Krankheiten wie Krebs beeinflussen. Eine abnormale Expression von miRNAs wurde inzwischen in einer Reihe von hämatologischen und soliden Tumorarten nachgewiesen und ist wahrscheinlich in vielen Fällen an der Tumorentstehung und Progression beteiligt.

Aufgrund ihrer offensichtlichen Rolle in der Pathogenese verschiedenster Erkrankungen sowie der Möglichkeit, Expressionsänderungen mit Krankheitsstadien zu assoziieren, eignen sich miRNAs als wertvolle diagnostische Biomarker. Expressionsmuster von miRNAs dienen als Biomarker-Signaturen für die akkurate Diagnose und Klassifikation humaner Erkrankungen wie beispielsweise Krebs [1]. Eine Biomarker-basierte Risikoerfassung selbst symptomfreier Patienten kann entscheidend zur frühzeitigen Detektion und spezifischen Diagnose beitragen und somit eine rechtzeitige therapeutische Intervention ermöglichen. Gerade für Tumorerkrankungen ist die frühzeitige Diagnose entscheidend für die Behandlung und die Lebensqualität betroffener Patienten. Die Analyse von miRNA-Expressionsmustern, also Sets von mehreren miRNAs, und nicht nur die Betrachtung einzelner miRNA-Biomarker ist dabei der Schlüssel für eine sichere und aussagekräftige Diagnose [2].

Aufgrund ihrer hohen Stabilität lassen sich miRNAs selbst aus schlecht konservierten Probenmaterialien, wie z.B. klinischen FFPE (formalin-fixed paraffin-embedded) Patientenproben für Untersuchungen isolieren. Gerade in der klinischen Forschung ist der Zugang zu Patientenmaterial von entscheidender Bedeutung, um Tests uneingeschränkt und routiniert durchführen zu können. Von besonders großem Interesse sind daher neueste Studien, die zeigen, dass miRNA-Biomarker-Analysen aus Blutproben möglich sind und einen vielversprechenden Ansatz für Blut-basierte diagnostische Tests darstellen [3, 4]. Ein minimal-invasiver Biomarker-Test kann somit in jede Standard-Blutuntersuchung integriert werden.

Mikrofluidische Biochips

Die enorme Entwicklung der miRNA-Forschung zeigt sich in der stetig steigenden Zahl der Publikationen zu diesem Thema sowie die der veröffentlichten miRNA-Sequenzen (Bild 1). In einer öffentlich zugänglichen Online-Sequenzdatenbank, der miRBase (www.mirbase.org), sind bereits weit mehr als 10 000 miRNA-Sequenzen gespeichert. Um ein umfassendes miRNA-Profiling durchführen zu können, benötigen die Forscher daher leistungsfähige Analysenmethoden, die einen sofortigen experimentellen Zugang zu den aktuellsten Updates der miRBase ermöglichen. Gerade für die Charakterisierung von Biomarker-Signaturen ist es wichtig, eine komplette Abdeckung aller bekannten Marker-Sequenzen zu gewährleisten: Bei solchen Signaturen wird eine Kombination mehrerer Biomarker für eine genauere Charakterisierung herangezogen. Jede einzelne miRNA kann hierbei von Bedeutung für das Ergebnis sein.

miRNA-Biomarker-Tests mit febits mikrofluidischen Biochips erfüllen neben diesem Anspruch vor allem die Voraussetzungen für einen routinemäßigen Einsatz in der klinischen Forschung: Mit der sensitiven Hochdurchsatz-Microarraytechnologie lassen sich Biomarkertests etablieren, für die nur minimale Mengen des oft limitierten Patientenmaterials benötigt werden und die auf Grundlage minimal-invasiv zugänglichen Probenmaterials wie Blut oder anderer Körperflüssigkeiten zuverlässige diagnostische Biomarker-Signaturen generieren. Zudem steht der implementierte Test für parallele Multiplex-Analysen und eine automatisierte Lösung, so dass große Anzahlen an Patientenproben zeit- und kosteneffektiv gemessen werden können sowie eine einfache Handhabung garantiert ist.

febits miRNA-Biochips (Bild 2) beruhen auf innovativen, mikrofluidischen Microarrays, die on-demand hergestellt werden. Das heißt, validierte Capture-Sonden werden anhand der neuesten Sequenzdaten unmittelbar in den Mikrokanälen des Biochips synthetisiert. Neben der immer aktuellsten Version der miRBase können auch beliebige, unveröffentlichte miRNA-Kandidaten ergänzt werden, so dass vollständige Analysen des miRNA-Transkriptoms gewährleistet sind; ein für die Entwicklung von Biomarker-Signaturen entscheidender Punkt. Mit dieser Flexibilität garantiert febits Technologieplattform diagnostische Tests, die immer up-to-date und gemäß den Anforderungen des klinischen Forschers produziert wurden. Analysiert werden die Biochips im Geniom RT Analyzer, der durch weitestgehende Automatisierung einen hohen Durchsatz und beste Reproduzierbarkeit der Testergebnisse gewährleistet. Die hohe Sensitivität des Systems ermöglicht die Analyse von minimalen RNA-Mengen, zum Beispiel aus Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Urin, die im Vergleich zu Gewebeproben deutlich leichter zugänglich sind, und minimal-invasive Tests unterstützten. Damit stellt die vorgestellte Technologie eine vielversprechende Testmethode für eine frühe Diagnose, Detektion und Bewertung von Krankheiten und ihren Verläufen dar.

Fallstudien

Eindrucksvoll belegt wurde das vorgestellte Verfahren in zwei Studien, die mit dem miRNA-Biomarker-Biochip und der Geniom RT Analyzer-Plattform von febit durchgeführt wurden. Der etablierte miRNA-Biochip wurde hier für die Untersuchung und Klassifikation von Lungenkarzinom- sowie Multiple Sklerose-Patienten [2, 5] eingesetzt, ausgehend von Blutproben der untersuchten Patienten. In beiden Studien konnte gezeigt werden, dass sich miRNAs im Blut verlässlich nachweisen lassen und das Erstellen diagnostischer Biomarker-Signaturen zur Patientenklassifikation ermöglichen (Bild 3). Hierfür wurden zunächst miRNA-Expressionsprofile mit Hilfe der Geniom miRNA-Biochips erstellt. Diese zeigten charakteristische Muster, die die Proben von Patienten mit kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC) bzw. Multipler Sklerose eindeutig von den Proben gesunder Kontrollpersonen unterscheiden konnten. Es folgte in beiden Studien eine bioinformatische Auswertung und Identifikation von Biomarker-Subsets. Diese enthielten in der Lungenkarzinom-Studie die Expressionsdaten von 24 und in der Multiple Sklerose-Studie die von 48 verschiedenen miRNAs.

Die mit den ausgewählten miRNAs erstellte Biomarker-Signatur ließ in der Lungenkrebsstudie eine Patientenklassifikation mit einer Genauigkeit von 95,4 %, einer Spezifität von 98,1 %, und einer Sensitivität von 92,5 % zu. Im Fall der Multiple Sklerose-Studie erfolgte eine Differenzierung zwischen Patienten mit RRMS (Relapsing-Remitting Multiple Sklerosis) und gesunden Probanden mit einer Genauigkeit von 96,3 %, einer Spezifität von 95 % und einer Sensitivität von 97,6 %. Mit der Auswahl von miRNA-Biomarkern aus einem umfassenden Expressionsprofil wurde somit ein Subset generiert, mit dem sich die Patientenproben mit größter Genauigkeit klassifizieren lassen. Diese Ergebnisse sind nicht nur vielversprechend im Hinblick auf eine neue Art der Diagnostik, sondern belegen auch den Zusammenhang zwischen deregulierten miRNAs und der Pathogenese bei Tumoren bzw. Multipler Sklerose.

Ausblick

Das große Potenzial der miRNAs als diagnostische Biomarker wurde in den vorgestellten Studien bereits eindrucksvoll belegt, und zukünftige Untersuchungen werden dieses Wissen im Umfeld der klinischen Forschung zur Anwendung bringen und erweitern. Biomarker, vor allem auf miRNA-Ebene aber auch auf genomischer Ebene, werden bei der Diagnose und Prognose komplexer Krankheiten wie Krebs eine zunehmend große Rolle spielen. Sie ermöglichen den Schritt hin zur sogenannten personalisierten Medizin, bei der Therapien anhand spezifischer genetischer Merkmale genauer auf den individuellen Patienten zugeschnitten werden können.

Dem Blick auf die genomische Ebene, der Suche nach somatischen Mutationen, zum Beispiel in den miRNA-Genen, widmen sich weitere Studien, die auf der gleichen Technologieplattform basieren. In diesen Studien wird febits HybSelect-Technologie zur Sequenzanreicherung Biomarker-relevanter genomischer Regionen angewendet. Mit Hilfe der flexiblen mikrofluidischen Biochips von febit werden Genombereiche, die analysiert werden sollen, gezielt angereichert, um sie anschließend mit den sogenannten Next Generation Sequencing (NGS)-Systemen zu sequenzieren. Auf diese Weise können SNP-Analysen durchgeführt, Targetgene charakterisiert und Mutationen aufgedeckt werden. Die HybSelect-Technologie gewährleistet einen hohen Patientenproben-Durchsatz bei der Suche und Identifikation genomischer Biomarker, was kosten- und zeiteffektive klinische Untersuchungen ermöglicht.
Dank innovativer Technologien wie den mikrofluidischen Geniom Biochips kann, ausgehend von leicht zugänglichen Patientenproben wie Blut, die Biomarker-basierte Patientenuntersuchung und Risikoerfassung entscheidend zur frühzeitigen Detektion und spezifischen Diagnose beitragen. Damit kann krankheitsübergreifend ein neuer Standard in der Diagnostik, bei Verlaufbeobachtungen und Prognose etabliert werden.

Literatur

  1. Croce CM, Calin GA. miRNAs, cancer, and stem cell division. Cell. 2005;122:6–7.
  2. Keller A et al. miRNAs in lung cancer – studying complex fingerprints in patient‘s blood cells by microarray experiments. BMC Cancer. 2009 Oct 6; 9:353.
  3. Chen X, Ba Y, Ma L, et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res 2008; 18:997-1006.
  4. Mitchell PS et al. Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection PNAS July 29, 2008 vol. 105 no. 30 10513-10518.
  5. Keller A et al. Multiple sclerosis: microRNA expression profiles accurately differentiate patients with relapsing-remitting disease from healthy controls. PLoS One. 2009 Oct 13; 4(10):e7440.
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