Entwicklung verbesserter ELISA-Tests

Nussallergenen auf der Spur

Nüsse sind eine Quelle von ungewollten Kontaminationen, weil Produktionslinien häufig für unterschiedliche Produkte genutzt werden. Eine präzise Analytik und die entsprechende Kennzeichnung auf Lebensmittelverpackungen ist vor allem für Allergiker wichtig. Neu identifizierte Peptide können zukünftig zur Entwicklung eines ELISA-Tests mit verbessertem Nachweis für geröstete Proben eingesetzt werden.

Auch Walnüsse können Allergien oder Unverträglichkeiten auslösen und sind daher deklarationspflichtig. © WBM/SKO

Allergische Erkrankungen betreffen in Deutschland ca. 30 Millionen Menschen, entsprechend könnten sie auch zu den Volkskrankheiten gezählt werden [1]. Insbesondere Nüsse können schwere allergische Reaktionen verursachen bis hin zu einem lebensgefährlichen Kreislaufzusammenbruch (Anaphylaxie). Da zurzeit noch keine Therapie für die Behandlung von Nahrungsmittelallergien zur Verfügung steht, müssen Allergiker das Allergen in ihren Lebensmitteln vermeiden. Allergenhinweise des Lebensmittelherstellers sind aus diesem Grund essenziell für die Gesundheit der Patienten [2]. Allergene, zu denen auch die Nüsse gehören, müssen daher immer auf Lebensmittelverpackungen gekennzeichnet werden, um Allergiker zu schützen. 

Der Gesetzgeber definiert in der Lebensmittel-Informationsverordnung (LMIV) in der Europäischen Union (EU) als Verordnung (EU) Nr. 1169/2011 (Anhang II) die Kennzeichnung von derzeit 14 Stoffen oder Erzeugnissen, die Allergien oder Unverträglichkeiten auslösen [3]. Zu den deklarationspflichtigen Nüssen zählen Mandeln, Haselnüsse, Walnüsse, Kaschunüsse (Cashewkerne), Pecannüsse, Paranüsse, Pistazien, Macadamia- und Queenslandnüsse sowie daraus gewonnene Erzeugnisse. Gerade Nüsse sind eine Quelle von ungewollten Kontaminationen, weil Produktionslinien häufig für unterschiedliche Produkte genutzt werden. Daher ist eine präzise Analytik sehr wichtig.

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Der Lebensmittelhersteller ist auf die Richtigkeit der Analysemethoden angewiesen. Zum heutigen Zeitpunkt können Nüsse oder andere zu kennzeichnende Allergene [4] sehr gut mit Hilfe von immunochemischen Methoden wie ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) und LFD/dipstick (Lateral Flow Devices), DNA (Desoxyribonucleic Acid)-basierten Techniken wie PCR (Polymerase Chain Reaction) und analytischen Methoden wie der Massenspektrometrie in Lebensmitteln nachgewiesen werden. Alle Techniken haben Vor- und Nachteile bei der Analyse von Lebensmitteln auf den Gehalt von Allergenen [5].

Prozessierung erschwert Wiederfindung
Ein Nachteil der aktuellen Nachweismethoden ist, dass die Wiederfindung von Nüssen in prozessierten Lebensmitteln, die z. B. geröstet oder gebacken wurden, oft nur begrenzt ist oder gar nicht erreicht wird [6]. Dies stellt einen großen Nachteil für Allergiker dar, da Lebensmittel, welche erhitzte Nüsse enthalten, als nussfrei gekennzeichnet werden könnten und somit ein erhöhtes Risiko darstellen. Durch die Prozessierung werden viele Proteine, unter anderem auch Allergene, in ihrer Struktur verändert (z. B. Oxidation von Cysteinen, Degradierung von Tryptophan, Deamidierung von Asparagin und Glutamin, Reaktion mit Zucker (Maillard Reaktion)) [7]. Diese Veränderungen können sich auf die Antikörperbindungsstellen (Epitope) auswirken und so die Erkennung durch den Antikörper beeinflussen.

Zudem kann die Löslichkeit der Proteine durch die Prozessierung (z. B. Denaturierung, Aggregation, Cross-linking) verändert und damit die Extraktion aus der Lebensmittelmatrix erschwert werden. Zudem werden im ELISA Antikörper verwendet, die meistens gegen Allergene aus nicht prozessierten Lebensmitteln gerichtet sind.

Es ist nicht bekannt, welchen Einfluss die Prozessierung auf das jeweilige Antigen (Allergen) hat, und ein Nachweis nach Prozessierung ist nicht sichergestellt. Aus diesen Gründen kann der ELISA, die zurzeit meistgenutzte Methode, eine verminderte Wiederfindung bei prozessierten Proben zeigen [6]. Ein verbesserter Nachweis von Nüssen in solchen prozessierten Lebensmitteln, insbesondere von Haselnuss und Mandel, würde zu einer erhöhten Sicherheit für Allergiker beim Konsum dieser Lebensmittel führen. Hierzu ist es wichtig, die Veränderungen durch Prozessierung festzustellen bzw. solche Proteine zu identifizieren, die von diesen wenig oder gar nicht betroffen sind. Diese stabilen Proteine eignen sich zur Generierung von Antikörpern, welche dann wiederum in neuen immunologischen Tests verwendet werden können.

Auf der Suche nach hitzestabilen Peptiden
Im Rahmen des von uns durchgeführten Projekts wurden Haselnuss und Mandel unter kontrollierten industrienahen Bedingungen in einem Trommelröster (Probatino) geröstet. Relevante Prozessparameter waren Rösttemperaturen zwischen 110 und 150 °C und Röstzeiten von 10 bis 30 min. Die gerösteten Nusschargen wurden zerkleinert und analysiert. Weiterhin wurden Kekse mit definierten Anteilen an gerösteten und ungerösteten Haselnüssen bzw. Mandeln gebacken. Hierfür wurden mit einem international etablierten, allergenfreien Keks-Standardrezept Spiking-Versuche durchgeführt. Wiederfindungen für ungeröstete Haselnüsse bzw. Mandeln bestätigten den Erfolg der Spike-Methode. Die gebackenen und vermahlenen Nusskekse wurden ebenso analysiert.

Nach dem Rösten bzw. Backen wurden die Nussproteine jeweils unter verschiedenen Bedingungen mit unterschiedlichen Puffern extrahiert und mittels SDS-PAGE (Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), MALDI-TOF-MS (Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation Massenspektrometrie) und LC-MS/MS (Liquid Chromatography Mass Spectrometry) analysiert und identifiziert. Ebenso wurde mit rohen Haselnüssen und Mandeln verfahren.

Die Analyse der Nussextrakte mit SDS-PAGE zeigte ein breites Spektrum an Proteinbanden für beide Nussarten. Die Ergebnisse mit kommerziellen ELISA-Tests zeigten eine geringere Wiederfindung mit zunehmenden Rösttemperaturen und Röstzeiten. Die gleiche abnehmende Wiederfindung wurde mittels Massenspektrometrie beobachtet. Jedoch konnten in den Keksproben, gespiked mit Mandel und Haselnuss aus hohen Rösttemperaturen, noch geringe Mengen Proteine nachgewiesen werden.

Somit enthalten Nüsse Peptide, die auch bei hohen Rösttemperaturen noch stabil sind. Diese stabilen Peptide, nachweisbar in rohen und hoch gerösteten Nussproben, wurden danach verwendet, um Antikörper zur Entwicklung eines ELISA-Tests mit verbessertem Nachweis für geröstete Proben zu erzeugen. Darüber hinaus wurden die Ergebnisse der LC-MS/MS-Experimente genutzt, um das zugrundeliegende Problem der unzureichenden ELISA-Wiederfindung bei kommerziellen Kits weiter aufzuklären. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Verlust der ELISA-Wiederfindung auch auf Ineffizienzen bei der Extraktion der verarbeiteten Nüsse und/oder einem möglichen Abbau der Proteine während der Verarbeitung zurückzuführen ist. Verschiedene identifizierte Peptide verhalten sich in der Wiederfindung nach dem Rösten unterschiedlich. Das Rösten von Nüssen führt zu einer Verringerung der Wiederfindung, das anschließende Backen hat keinen zusätzlichen Effekt.

Fazit
Aktuell eingesetzte Nachweismethoden für Nuss-Allergene erreichen teilweise nach der Prozessierung (bei hohen Temperaturen) der nusshaltigen Lebensmittel nicht mehr oder nur eingeschränkt die Wiederfindung dieser Allergene. Im Rahmen unseres Projekts haben wir Peptide identifiziert, die auch bei hohen Rösttemperaturen stabil sind. Diese Peptide können zukünftig zur Erzeugung von Antikörpern eingesetzt und für die Entwicklung eines ELISA-Tests mit verbessertem Nachweis für geröstete Proben verwendet werden.

Der Verlust der ELISA-Wiederfindung ist unseren Ergebnissen nach auch auf Ineffizienzen bei der Extraktion der verarbeiteten Nüsse und/oder einem möglichen Abbau der Proteine während der Verarbeitung zurückzuführen. Im Rahmen dieses Projektes wurden auch die Extraktionsmethoden optimiert.

Literaturverzeichnis

[1] Klimek L et al. Weißbuch Allergie in Deutschland. Springer Medizin Verlag GmbH, 2018.
[2] Brough HA et al. Dietary management of peanut and tree nut allergy: what exactly should patients avoid? Clin. Exp. Allergy, 2015, 45:859-871.
[3] REGULATION (EU) No 1169/2011 OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL of 25 October 2011 on the provision of food information to consumers, amending Regulations (EC) No 1924/2006 and (EC) No 1925/2006 of the European Parliament and of the Council, and repealing Commission Directive 87/250/EEC, Council Directive 90/496/EEC, Commission Directive 1999/10/EC, Directive 2000/13/EC of the European Parliament and of the Council, Commission Directives 2002/67/EC and 2008/5/EC and Commission Regulation (EC) No 608/20, Official Journal of the European Union 2011, L304:18-63.
[4] Taylor SL, Baumert JL. Worldwide Food Allergy Labeling and Detection of Allergens in Processed Foods. Chem. Immunol. Allergy, 2015, 101:227-234.
[5] Baumert, JL. Detecting and Measuring Allergens in Food, In: Risk Management for Food Allergens. Food Science and Technology International Series. Oxford, Elsevier, 2014, 13:215-226.
[6] Parker CH et al. Multi-allergen Quantitation and the Impact of Thermal Treatment in Industry-Processed Baked Goods by ELISA and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry. J. Agric. Food Chem., 2015, 63(49):10669-10680.
[7] Johnson PE et al. Current Perspectives and Recommendations for the Development of Mass Spectrometry Methods for the Determination of Allergens in Food. J. AOAC Int, 2011, 94(4):1026-1033.

AUTOREN
Prof. Dr. Simone Loos-Theisen
Hochschule Geisenheim University
Institut für Lebensmittelsicherheit

Dr. Susanne Siebeneicher
R-Biopharm AG, Darmstadt

Prof. Dr. Klaus Schneider
Hochschule Fresenius, Idstein
Fachbereich Chemie & Biologie


Dieses Projekt (HA-Projekt-Nr. 513/16-25) wird im Rahmen von Hessen ModellProjekte aus Mitteln der LOEWE – Landes-Offensive zur  Entwicklung Wissenschaftlichökonomischer Exzellenz, Förderlinie 3: KMU-Verbundvorhaben gefördert.

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