Publikations-Check

Welche ist die beste RNA-seq-Methode für quantitatives miRNA Profiling?

Warum setzen Wissenschaftler die RNA-Seq-Methode ein? Was hat es mit der kleinen RNA-Sequenzierung auf sich und wie kann sie für ein miRNA-Profiling genutzt werden? Die Autorin gibt einen Überblick über die Methode generell und stellt eine Publikation vor, in der verschiedene Methoden zur Herstellung von Bibliotheken verglichen wurden, um ihre Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und Fähigkeit zur Erkennung von miRNAs zu bewerten.

Tabelle 1: Vergleich RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) mit Microarrays und EAS-Sequenzierung. © Proteintech

Die RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ist eine weit verbreitete Methode, bei der Next-Generation-Sequencing (NGS) eingesetzt wird, um RNA-Moleküle in biologischen Proben nachzuweisen und zu quantifizieren. RNA-Seq hat den Ansatz der Transkriptomik revolutioniert, ermöglicht einen Hochdurchsatz und ist eine präzise und kostengünstige Analyse von RNAs, die Vorteile gegenüber Microarrays und der EAS-Sequenzierung [1] besitzt (Tabelle 1).

Die RNA-seq-Technologie findet Verwendung in der Grundlagenforschung und in der klinischen Forschung. Sie wird hauptsächlich verwendet für:

  • funktionelle Annotation von Genomen durch Identifizierung aller kodierenden und nicht-kodierenden RNAs, Spleißstellen, Isoformen, offener Leserahmen;
  • quantitative Analyse von RNA-Expression und Expressionsprofilen;
    Detektion von Einzelnukleotid-Polymorphismen;
  • Erforschung der RNA-Bearbeitung - RNA posttranskriptionelle Modifikationen (PTMs).
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Spezielle RNA-Seq-Setups können sich auf Teilmengen von RNAs konzentrieren, z. B. kodierende RNAs (mRNA-Sequenzierung und Exom-Capture) oder ribosomale RNAs (Ribosomenprofilierung). Eine erhöhte Sensitivität des RNA-Nachweises führte zur Entwicklung von Einzelzell-Sequenzierungszellen (single cell RNA-seq), die ein wertvolles Instrument zur Untersuchung der Gewebekomplexität oder heterogener Zellpopulationen auf Einzelzellniveau sind.

Bild 1: Anwendungen der RNA-Seq-Technologie in der Grundlagen- und klinischen Forschung. © (Dr. Tomasz Witkos, School of Biology, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, Manchester, United Kingdom

RNA-seq wurde entwickelt, um die RNA-Struktur zu bestimmen (selektive 2'-Hydroxyl-Acylierung durch Primer-Extension - SHAPE) und RNA-RNA- und RNA-Protein-Interaktionsstellen (Crosslinking Immunoprecipitation - CLIP) zu kartieren (Bild 1).


Herausforderungen in kleinen RNA-Seq

Vor nur zehn Jahren entwickelt, wurde RNA-Seq zuerst für poly-A-haltige Boten-RNAs verwendet [2-4]. Standard-RNA-Sequenz („long RNA-seq“) wird für die Sequenzierung von Messenger-RNAs und langen nicht-codierenden RNAs verwendet. Es basiert auf der RNA-Isolierung, gefolgt von seiner Fragmentierung auf die gewünschte Länge (30 - 400 bp), die als nächstes in cDNA umgeschrieben wird. Im Gegensatz dazu sind kleine RNAs, wie reife microRNAs (miRNAs), die ~ 22 Nukleotide lang sind, zu klein für Standard-RNA-Seq-Protokolle.
Aufgrund der geringen Länge von miRNAs sind zusätzliche Verlängerungsschritte (wie RNA-Ligation oder Poly-A-Tailing) während der Bibliothekenherstellung erforderlich, um eine unbelastete und effiziente reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-Amplifikation („small RNA-seq“) zu ermöglichen (Bild 2).

Speziell für biologische Proben mit geringer RNA-Häufigkeit, wie z.B. die Untersuchung von zirkulierenden zellfreien miRNAs im Blut, ist eine korrekte Normalisierungs- und Reproduzierbarkeitsbewertung erforderlich.

Giraldez et al. verglichen in ihrer Publikation in Nature Biotechnology [5] neun verschiedene Methoden zur Herstellung von Bibliotheken, um ihre Reproduzierbarkeit, Genauigkeit und Fähigkeit zur Erkennung von miRNAs zu bewerten. Dieses „Benchmarking“ wurde unter Verwendung von drei Referenzproben durchgeführt:

  1. ein äquimolarer Pool von mehr als 1000 kurzen synthetischen RNAs;
  2. Pools von kleinen synthetischen RNAs, die in verschiedenen Molverhältnissen gemischt sind;
  3. ein kleiner RNA-Pool, isoliert aus menschlichem Blut.

Neun unabhängige Forschungsgruppen erstellten und analysierten Bibliotheken in Replikaten, was zu einer beeindruckenden Anzahl von 364 RNA-Seq-Datensätzen führte.

Verschiedene Methoden – RNA-seq

Mehrere kommerzielle und „hauseigene“ Methoden wurden entwickelt, um kleine RNA-Sequenz-Experimente durchzuführen. Die meisten verfügbaren Methoden erfordern 3' und 5' Adapter-Ligaturen. Dies ist ein entscheidender Schritt, der direkte Auswirkungen auf Qualität und Selektivität von amplifizierten RNAs hat. Es wurde gezeigt, dass RNA-Ligasen (Rnl1 und Rnl2), die in Ligationsschritten verwendet werden, Sequenz- und Strukturverzerrungen aufweisen, die zu einer Überrepräsentation und Unterrepräsentation bestimmter RNA-Untergruppen führen [6, 7].

Bild 2: Experimentelle Schritte der kleinen RNA-Seq. © Dr. Tomasz Witkos, School of Biology, Faculty of Biology, Medicine and Health, University of Manchester, Manchester, United Kingdom

Aktuelle Protokolle und Strategien für kleine RNA-Seq können in zwei Kategorien unterteilt werden: diejenigen, die Adapter mit invarianten Enden verwenden, wobei Adapter streng vordefinierte Sequenzen haben, und solche mit Adaptern, die vier degenerierte Nukleotide an den Ligationsenden enthalten (4N-Adapter) (Bild 2).

Giraldez et al. evaluierten drei kommerzielle Kits mit invarianten Enden: TruSeq (Illumina), Nebnext (New England BioLabs) und CleanTag (Trilink Biotech) und sechs Protokolle mit 4N-Adaptern: kommerzielles Nextflex (Bioo Scientific), ein kürzlich veröffentlichtes Protokoll von Ping und Kollegen [8] und vier Inhouse-Protokolle.

1. Sequenz-Bias ist ein großes Problem
Giraldezet al. [5] berichtet, dass derzeit verwendete Protokolle für kleine RNA-seq Sequenzfehler aufweisen. Der beobachtete Sequenz-Bias zwischen verschiedenen Protokollen war signifikant höher als zwischen Datensätzen, die von verschiedenen Forschungsgruppen unter Verwendung des gleichen Protokolls erzeugt wurden. Das legt nahe, dass die Wahl des Protokolls für RNA-seq einen großen Einfluss auf die Qualität der erhaltenen Daten hat. Dies sollte beim Vergleich kleiner RNA-Seq-Ergebnisse ähnlicher biologischer Phänomene, die unter Verwendung verschiedener Bibliotheks-Herstellungsprotokolle analysiert wurden, im Hinterkopf behalten werden. 

Der 4N-Adapter hat eine beträchtlich kleinere Sequenzabweichung (2 – 20-fach in Abhängigkeit vom Protokoll) als invariante Adaptermethoden hervorgebracht und ist daher eine bevorzugte Wahl. Ein reduzierter Sequenz-Bias in 4N-Adapterprotokollen legt auch nahe, dass sie zur Detektion für eine Vielzahl kleiner RNA-Spezies (Probenabdeckung) besser geeignet sind, selbst wenn die Sequenzierung eine geringere Tiefe aufweist.

2. Schlussfolgerung: kleine RNA-Seq-Protokolle sind genau und reproduzierbar 
Die Verwendung von vordefinierten Pools kleiner synthetischer RNAs ermöglichte den Vergleich aller Protokolle hinsichtlich ihrer Genauigkeit und Reproduzierbarkeit zwischen verschiedenen Forschungsgruppen. Die beobachteten miRNA-Häufigkeitsverhältnisse lagen sehr nahe bei den erwarteten Verhältnissen. Das bedeutet, dass alle Protokolle korrekt waren, um die korrekte relative miRNA-Häufigkeit zu erhalten. Die Reproduzierbarkeit wurde in synthetischen und biologischen RNA-Proben mittels statistischer Parameter (Variationskoeffizient, Quartilskoeffizient der Dispersion) gemessen. Detaillierte Ergebnisse sind im ergänzenden Datensatz zusammengefasst (die Koeffizientenvariation für die meisten identifizierten RNAs lag unter 20%) [5].

3. Wichtiges Resultat: Die Erkennung von miRNA ist mit einem hauseigenen 4N-Adapterprotokoll am zuverlässigsten
Die Desaminierung von Adenosinresten zu Inosin (A-zu-I-Editierung) kann in einer Untergruppe von miRNA-Vorläufern auftreten. Es hat Auswirkungen auf Ihre weitere Verarbeitung und biologische Aktivität [9]. Daher ist es wichtig, dass Forscher eine geeignete RNA-Seq-Methode verwenden, die einen präzisen Nachweis der A-zu-I-miRNA-Bearbeitung ermöglicht.
Unter Verwendung eines Referenzpools von aufbereiteten und unbearbeiteten kleinen synthetischen RNAs, die in unterschiedlichen Molverhältnissen gemischt sind, haben Giraldez et al. [5] festgestellt, dass drei von neun Protokollen die Erkennung von A-zu-I-miRNA-Editierungen erlauben. Alle untersuchten Protokolle hatten eine gute Spezifität (> 99%), um editierte und unbearbeitete RNAs in Proben zuverlässig zu erkennen und zwischen ihnen zu unterscheiden. Ein internes 4N-Adapter-Protokoll schnitt jedoch besser ab als kommerzielle invariante Adapterprotokolle, um tatsächliche Editierpegel genau zu erkennen. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass 4N-Adapterprotokolle mit einer geringeren Sequenzabweichung die Sequenzabdeckung maximieren und daher invariante Adapterprotokolle übertreffen.

Weitere Verbesserungen erforderlich ...

Ohne Zweifel hilft diese umfassende Studie Forschern, die Protokolle und experimentellen Designdetails für kleine RNA-seq weiter zu verfolgen. Kleine RNA-Sequenzen zeigen immer noch große Sequenzabweichungen im Vergleich zu langen RNA-Sequenzen. Neuere Untersuchungen von kleinen RNA-Seq-Analysen, die 4N-Adaptoren verwendet haben, scheinen eine geringere Sequenzabweichung zu ergeben. Es ist erwähnenswert, dass die vier untersuchten 4N-Adapterprotokolle Datensätze mit unterschiedlicher Qualität erzeugten, was nahe legt, dass zusätzliche Parameter wie Ligationszeiten und -temperaturen bei der Durchführung von Experimenten bezüglich kleiner RNA-seq berücksichtigt werden sollten.

Isolierte kleine RNAs durchlaufen zwei Runden von Ligationen mit 3'- und 5'-Adaptern und diese Reaktionen werden durch zwei RNA-Ligasen katalysiert. Die erzeugten Produkte dienen als Matrizen für die reverse Transkription und DNA-Fragmente werden durch einige PCR-Zyklen amplifiziert. Amplifizierte DNA-Produkte werden einer Sequenzierung unterzogen. Giraldez et al. [5] verglichen neun Protokolle, die 3'- und 5'-Adapter entweder mit invarianten Enden oder Adaptoren mit vier degenerierten Nukleotiden an ihren Ligationsenden verwenden. Die Abbildung zeigt als Vereinfachung nur Varianten von 3 '-Adapterenden.

Der Beitrag basiert auf der Publikation: Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling Nature Biotechnology volume 36, pages 746–757 (2018)

AUTORIN
Dr. Karolina Szczesna
Product Manager and Technical Support Proteintech Ltd.
ptglab.com


Zum Unternehmen:
Proteintech versteht die Bedeutung von Antikörpern mit hoher Spezifität und Reproduzierbarkeit. Jeder Proteintech-Antikörper wird intern hergestellt und validiert, einschließlich der Verwendung von siRNA-Knockdown, um die Spezifität zu demonstrieren. Vor diesem Hintergrund stellt Proteintech jeden Antikörper im eigenen Haus aus ganzen Proteinimmunogenen her und ermöglicht so die vollständige Kontrolle über Qualität und Validierung.

Referenzliste

  1. Wang, Z., M. Gerstein, and M. Snyder, RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet, 2009. 10(1): p. 57-63.
  2. Mortazavi, A., et al., Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods, 2008. 5(7): p. 621-8.
  3. Nagalakshmi, U., et al., The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science, 2008. 320(5881): p. 1344-9.
  4. Wilhelm, B.T., et al., Dynamic repertoire of a eukaryotic transcriptome surveyed at single-nucleotide resolution. Nature, 2008. 453(7199): p. 1239-43.
  5. Giraldez, M.D., et al., Comprehensive multi-center assessment of small RNA-seq methods for quantitative miRNA profiling. Nat Biotechnol, 2018. 36(8): p. 746-757.
  6. Jayaprakash, A.D., et al., Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Res, 2011. 39(21): p. e141.
  7. Zhuang, F., et al., Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3'-adapter ligation. Nucleic Acids Res, 2012. 40(7): p. e54.
  8. Ping, X., et al., An improved protocol for small library construction using High Definition adapters. Methods Next-Generation Seq., 2015(2): p. 1-10.
  9. Yang, W., et al., Modulation of microRNA processing and expression through RNA editing by ADAR deaminases. Nat Struct Mol Biol, 2006. 13(1): p. 13-21.
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