Wirtschaftliche Vorteile für Biopharmaka-Hersteller

Kontinuierliche Chromatographie

Dr. Romas Skudas*), Dr. Sven Andrecht*), Dr. Christopher Gillespie

  1. Dr. Michael Phillips**)
  1. Merck Millipore Division - Process Solutions, Merck KgaA, Frankfurter Str. 250, 64293 Darmstadt E-Mail: romas.skudas@merckgroup.com.
  2. EMD Millipore Corp, 80 Ashby Road, Bedford, MA 01730, USA.
Die kontinuierliche Chromatographie wurde in den 1950er Jahren in der petrochemischen Industrie eingeführt und wird heute verbreitet bei der Herstellung kleiner Wirkstoffmoleküle eingesetzt. Vor Kurzem haben Biopharmaka-Hersteller begonnen, diese Technologie auch für die Herstellung von größeren, proteinbasierten Arzneimitteln anzuwenden. Dieser Trend dürfte sich angesichts der Bemühungen der Industrie nach produktiveren, kosteneffektiveren Prozessen noch weiter verstärken.

In der vorliegenden Studie beurteilten wir die Auswirkungen der kontinuierlichen Chromatographie auf Geschwindigkeit, Gelnutzung, Produktionsflexibilität und Risikoreduzierung (Bild 1). In Bezug auf Geschwindigkeit und Kosten wurde untersucht, ob mit der kontinuierlichen Chromatographie die Produktionszeit verkürzt werden kann und ob mit kleineren Geräten eine gleichwertige Prozessleistung bei reduzierten Herstellungskosten zu erzielen ist. In Bezug auf Produktionsflexibilität wurde geprüft, ob Einwegprodukte für die Produktion eingesetzt werden können und ob die Anlagenkonfiguration vom Trennmechanismus (z.B. Affinität, Ionenaustausch) abhängig ist.

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Prinzip der kontinuierlichen Chromatographie

Im ersten Teil der Studie untersuchten wir die Anwendung der kontinuierlichen Chromatographie für eine affinitätsbasierte Trennung (ProSep®-vA, Merck Millipore). Bild 2a zeigt eine grafische Darstellung der Konzentration eines Proteins, wenn die Säule vor dem Proteindurchbruch beladen wird. Die blaue Zone repräsentiert eine Gelsättigung von nahezu 100 % mit einem Konzentrationsabfall entlang der Säulenlänge zur gelben Zone, in der nur eine geringe oder keine Proteinbindung an der Säule vorliegt. Dieser Ansatz wird im normalen Batchbetrieb angewendet, um Produktverluste während der Beladungsphase zu vermeiden. Bei einem kontinuierlichen Trennverfahren kann durch Aufteilung auf zwei gleiche Säulen die erste Säule bis zur Sättigung beladen werden, während die zweite Säule Protein bindet, das nicht an die erste Säule gebunden wurde (Bild 2b).

Wir führten ein kontinuierliches Trennverfahren mit drei Säulen durch, wobei nur von einer gesättigten Säule eluiert wurde. In Bild 2b ist Säule 1 völlig blau, d.h. gesättigt. Diese Säule wird zum Waschen, Eluieren und Reinigen aus der Beladungszone genommen; Säule 2, die nicht gesättigt ist, wird in die erste Beladungsposition versetzt, um eine Sättigung zu ermöglichen, und Säule 3 wird in die zweite Beladungsposition versetzt. Auf diese Weise wird eine viel höhere Gelbeladung von bis zu 90 % erzielt. Die restlichen Schritte, Waschen, Eluieren und Reinigen, wurden wie im Batchprozess durchgeführt; die deutliche Verbesserung wurde durch Änderung der Beladung erzielt.

Die Standardmethode zur Bestimmung der Säulenkapazität für die Produktion ist die Messung des Proteindurchbruchs (BT) am Säulenausgang. Bild 2a zeigt ein repräsentatives Beispiel einer BT-Kurve, auf der ein BT von 5 % markiert ist. Um ein gewisses Sicherheitsniveau in Bezug auf Produktverlust zu gewährleisten, wird eine Säule auf etwa 80 % dieses Niveaus beladen. Bei der kontinuierlichen Chromatographie (Bild 2b) wird der BT der ersten Säule auf einer zweiten, in Reihe geschalteten Säule „abgefangen“. Bei diesem Betrieb sind Säule 1 und Säule 2 im Prinzip miteinander gekoppelt und arbeiten zusammen; Säule 3 wird daher als eigenständige Säule behandelt. Wenn Säule 1 ausreichend beladen ist, wird Säule 2 zur primären Beladungssäule, die dann mit Säule 3 gekoppelt und von Säule 1 getrennt wird; in der letzten Phase ist Säule 3 die primäre Beladungssäule, die mit Säule 1 gekoppelt ist. Diese Säulenrotation wird fortgesetzt und es werden verschiedene Eluatpools gesammelt, bis die Prozesslösung verbraucht ist oder eine bestimmte Anzahl von Säulenzyklen durchlaufen wurde. Bei dieser Konfiguration findet eine kontinuierliche Beladung statt.

Produktivität und Verweilzeit

Tabelle 1A zeigt die angewendete Verweilzeit, die erzielte Ausbeute und Produktivität für eine affinitätsbasierte Trennung sowohl im Batchverfahren als auch im kontinuierlichen Verfahren mit drei Säulen. Eine affinitätsbasierte Trennung wurde als Ausgangspunkt gewählt, da diese Gele typischerweise am teuersten sind und jede Erhöhung der Effizienz und Produktivität entsprechende Kosteneinsparungen erzielen würde. Beim Einsäulen-Batchverfahren und einer Verweilzeit von 4 min wurde eine Ausbeute von 95 % bei einer HCP-Konzentration von 1251 ppm erzielt. Die Produktivität von etwa 7 g/l/h wurde daraus berechnet, wie viel Material pro Liter Gel pro Zeiteinheit aufgereinigt werden kann.

Wenn der gleiche Verfahrensschritt mit einer viel kürzeren Verweilzeit (0,22 min) durchgeführt wird, kann die Produktivität bei ähnlicher Reinheit erhöht werden. Bei Anwendung des kontinuierlichen Verfahrens wird die Produktivität 20-fach erhöht.

Tabelle 1B zeigt die berechneten prozentualen Einsparungen in Bezug auf Prozessdauer, Gelverbrauch und Pufferverbrauch für den Capture-Schritt bei der Aufreinigung monoklonaler Antikörper (mAk) aus 2000 l geklärter Zellerntelösung mit einer anfänglichen mAk-Konzentration von 2 g/l. Die Ergebnisse zeigen, dass bei Anwendung einer kontinuierlichen Methode die Leistung und die Robustheit des Prozesses aufrechterhalten wurden, während eine deutlich höhere Produktivität bei geringerem Gel- und Pufferverbrauch erzielt wurde.

Mit der kontinuierlichen Chromatographie konnten wir einen äußerst robusten und konsistenten Prozess erzielen, der für die Downstream-Verarbeitung kritisch ist. Die Daten in Bild 3 zeigen eine konsistente mAk-Konzentration sowie einen konsistenten pH-Wert im Eluatpool über den gesamten Verlauf eines kontinuierlichen Verfahrens, was auf einen robusten Prozess hindeutet.

Von diesen Ergebnissen für Affinitätsseparationen ausgehend, wurde die kontinuierliche Chromatographie auf andere Modalitäten, einschließlich Ionenaustausch, angewendet.

Ionenaustausch

Zur Untersuchung der Anwendung kontinuierlicher Chromatographie für Ionen-austauschverfahren verwendeten wir einen Antikörperpool nach der Protein-A-Aufreinigung. Tabelle 2 zeigt einen Leistungsvergleich zwischen Kationenaustauschprozessen im Batchmodus und im kontinuierlichen Verfahren.

Während die Produktivität des Kationenaustauschverfahrens im Batchmodus deutlich höher ist als im Affinitätsmodus, wird im kontinuierlichen Modus ein achtfacher Anstieg der Produktivität bei vergleichbarer Reinheit und Ausbeute erzielt. Ein kontinuierliches Verfahren mit vier Säulen ergab keinen signifikanten Anstieg der Produktivität.

Vorteile auf einen Blick

Bei allen Modalitäten wurden fünf eindeutige Vorteile der kontinuierlichen Chromatographie beobachtet (Tabelle 3). Die Prozessdauer kann durch höhere Geschwindigkeiten verkürzt werden und die beobachtete Erhöhung der Produktivität kann die Herstellungskosten reduzieren, da pro Prozess weniger Puffer verbraucht wird.

In Bezug auf Risikoreduzierung werden durch Anwendung kleinerer Säulen kleinere Zwischenbatchgrößen erzielt. Im Vergleich dazu befindet sich beim Einsäulenbetrieb alles in einem Pool. Der geringere Gel- und Pufferverbrauch erfordert außerdem eine geringere Investition pro Kampagne. Bei der kontinuierlichen Methode könnte die gleiche Gerätekonfiguration ungeachtet der Chromatographieanwendung (z.B. Ionenaustausch, Affinität) verwendet werden.

Zusammenfassung

Mit der kontinuierlichen Chromatographie konnten wir einen mehr als zehnfachen Anstieg der Produktivität bei gebräuchlichen Antikörper-Capture-Schritten demonstrieren, wobei ProSep®-vA-Affinitätsmedien und in mehreren Zelllinien exprimierte mAk-Titer von 0,5 bis 5 g/l angewendet wurden.

Zudem wurde die Robustheit dieser Technologie in verschiedenen Ionenaustauscherschritten mit Eshmuno®-S-Gelen belegt, bei denen ein über siebenfacher Produktionsanstieg erzielt wurde. Diese höhere Produktivität kann ohne Einbußen der Reinheit oder Ausbeute mit geringerem Lösungsmittel-, Puffer- und Gelverbrauch und bei gleichem Platzbedarf erzielt werden. Des Weiteren wurde eine verbesserte Gelnutzung mit >100 Zyklen für eine einzelne Upstream- Batchaufreinigung erzielt.

Aufgrund der verbesserten Produktion sowie der Zeit- und Materialeinsparungen kann das kontinuierliche Verfahren die Kosten für chromatographische Prozesse um bis zu 50 % reduzieren ( z.B. die Antikörper-Aufreinigung im klinischen Maßstab). Bei der Aufreinigung im Prozessmaßstab sind die Vorteile geringer, mit einer Kostenreduzierung von etwa 10 % jedoch weiterhin signifikant. In beiden Maßstäben kann die kontinuierliche Chromatographie voll automatisiert werden und dadurch Einsparungen bei der Durchführung des Chromatographieprozesses ermöglichen.

Ein weiterer wichtiger Vorteil der kontinuierlichen Chromatographie ist, dass dieses Verfahren den Grundlagen des Konzepts „Quality by Design“ (QbD) entspricht. Prozessanalysenmethoden (PAT) können im Gegensatz zu Batchprozessen während des Verfahrens angewendet werden, was Anwendern eine QbD-konforme Definition des Designspace ermöglicht. Dadurch wird die von den Aufsichtsbehörden erwartete Einheitlichkeit und Qualität verbessert. Validierung ist ein wichtiger Aspekt, der gesonderte Aufmerksamkeit erfordert.

Die kontinuierliche Chromatographie vereinfacht auch das Scale-up. Bei der Batch-Chromatographie resultiert ein Scale-up der Chromatographiesäulen oftmals in Produktionssäulendurchmessern von über einem Meter. Bei der kontinuierlichen Chromatographie kann der Scale-up-Faktor bis zu fünfmal kleiner sein, wodurch der Durchmesser einer Produktionssäule von 1 Meter auf 20 Zentimeter reduziert wird.

Während Biopharmakahersteller den finanziellen Herausforderungen von abgelaufenen Patenten, Biosimilars und Generika gegenüberstehen, müssen sie Wege zur Reduzierung ihrer Produktionskosten finden, um konkurrenzfähig zu bleiben. Dies dürfte zu einer breiteren Anwendung der kontinuierlichen Chromatographie führen.

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