Spezifisch und wirkungsbezogen

Bisphenole im Spurenbereich messen mit Ready-to-use-Hefezell-Assay

A-YBS (Arxula-Yeast Bisphenol Screen), ein Biosensor auf Basis der Hefe Arxula adeninivorans, ermöglicht die wirkungsbezogene Analyse von Bisphenolen in wässrigen Extrakten und Proben.

Bisphenol A wird in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie zur Herstellung des Kunststoffs Polycarbonat (PC) sowie für die Herstellung von Innenbeschichtungen von Getränke- und Konservendosen verwendet. © Pixabay

Die Gruppe der Bisphenole umfasst 16 verschiedene Verbindungen, die eine ähnliche Grundstruktur aus zwei Phenolringen mit einer variablen chemischen Gruppe zwischen den beiden Phenolringen aufweisen. Der prominenteste Vertreter ist Bisphenol A (BPA), das durch die Reaktion von zwei Phenol-Molekülen mit einem Aceton-Molekül hergestellt wird. Die globale Produktion von BPA beläuft sich jährlich auf mehrere Millionen Tonnen und wird nach Schätzungen im Jahr 2023 ca. 7,4 Millionen Tonnen betragen [1].

Besorgniserregende Substanz Bisphenol A

Bisphenol A wird in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie hauptsächlich zur Herstellung des Kunststoffs Polycarbonat (PC), welches für die Produktion von Behältern und Flaschen verwendet wird, sowie für die Herstellung von Innenbeschichtungen von Getränke- und Konservendosen eingesetzt. Im Juli 2016 wurde Bisphenol A in der EU als reproduktionstoxisch (Kategorie 1B nach der CLP-Verordnung) eingestuft, und basierend auf dieser Einstufung wird BPA seit 2017 als besonders besorgniserregende Substanz (Substances of Very High Concern, SVHC) nach der REACH-Verordnung gelistet [2]. Durch die Initiative des Umweltbundesamtes erfolgte nach Bewertung wissenschaftlicher Studien Ende 2017 die Identifizierung von BPA als „Endokriner Disruptor“ durch die Europäische Chemikalienagentur (ECHA).

Anzeige

Endokrine Disruptoren verändern die Aktivität des endokrinen Systems, indem sie an nukleäre Hormonrezeptoren binden und die Wirkung natürlicher Liganden imitieren. Bisphenol A zeigt ein schwaches estrogenes Potenzial, d. h. es bindet an den Estrogenrezeptor und löst Effekte aus, die beispielsweise im Fortpflanzungssystem negative Veränderungen hervorrufen. Grenzwerte für Stoffe in Materialien und Gegenstände aus Kunststoff, die mit Lebensmitteln in Kontakt kommen, sind in der Verordnung (EU) Nr. 10/2011 festgelegt. Die Menge an Bisphenol A, die aus einem Lebensmittelbedarfsgegenstand aus Kunststoff, z. B. einer Verpackung, in das Lebensmittel übergeht, ist als „Spezifischer Migrationsgrenzwert (SML)“ definiert. Für Bisphenol A ist der SML auf 600 µg pro Kilogramm Lebensmittel bzw. Lebensmittelsimulanz festgesetzt [2].

Etablierte Verfahren erfassen nicht (anti)estrogenes Gesamtpotenzial

Die Analytik von BPA erfolgt vorwiegend mittels chromatographischer Methoden in Kombination mit Massenspektrometrie (GC-MS und LC-MS) nach Extraktion des Analyten aus der Probenmatrix. Darüber hinaus kommen vereinzelt immunologische Methoden, z. B. ELISA, zum Einsatz. Diese etablierten Analyseverfahren für Bisphenol A bieten den Vorteil, dass sie genaue Auskunft über die Art und Konzentration der in einer Probe enthaltenen Bisphenole geben können; jedoch können sie das (anti)estrogene Gesamtpotential dieser Probe nicht erfassen, so dass wirkungsbezogene Tests eine sinnvolle Ergänzung für die etablierten Analyseverfahren darstellen. Beispielsweise kann solch ein wirkungsbezogener Nachweis mittels Hefezell-Tests erfolgen. Jedoch spielten bisher derartige Bio-Assays auf Basis von Mikroorganismen für den Nachweis von Bisphenolen keine entscheidende Rolle, da sie insbesondere gegenüber Bisphenol A eine vergleichsweise geringe Sensitivität aufweisen, aber trotzdem stark auf natürliche und synthetische Estrogene ansprechen.

Bild 1: Schematische Darstellung des Arxula adeninivorans-Biosensors im A-YBS. © new_diagnostics GmbH © New Diagnostics GmbH

Im Folgenden wird mit dem Arxula-Yeast Bisphenol Screen (A-YBS) ein biologisches Messverfahren auf Basis einer Hefe vorgestellt, das für die wirkungsbezogene Analyse speziell von Bisphenolen in wässrigen Extrakten und Proben geeignet ist, da es einerseits eine hohe Sensitivität gegenüber Bisphenolen und andererseits eine deutlich geringere Sensitivität gegenüber Estrogenen aufweist. Zentraler Bestandteil des A-YBS ist die nichtkonventionelle und gentechnisch veränderte Hefe Arxula adeninivorans, in deren Genom eine Rezeptorgen- und eine Reportergenkassette stabil integriert wurden [3] (Bild 1).

Durch gezielte Änderungen in der DNA-Sequenz im Gen des humanen Estrogenrezeptors α können Bisphenole, insbesondere Bisphenol A und Bisphenol Z, als Summenparameter quantitativ erfasst werden. Grundlage für das Verfahren bilden die wissenschaftlichen Arbeiten von Johanna Rajasärkkä et al. zur ortsspezifischen Mutagenese im Gen des humanen Estrogenrezeptors α und des daraus resultierenden Austausches von mehreren Aminosäuren im Estrogenrezeptor α [4]: Im Hefe-Reportergen-Assay mit Saccharomyces cerevisiae konnte damit eine deutlich gesteigerte Spezifität und Nachweisempfindlichkeit für Bisphenol A in Kombination mit einem Biolumineszenzreporter erreicht werden.

Tabelle 1: Relative Potenzen verschiedener Bisphenole und Estrogene im A-YBS, bezogen auf Bisphenol A.

Die Übertragung dieses Prinzips des gezielten Austauschs von Aminosäuren im Gen des Estrogenrezeptors α wurde auf das Arxula-Biosensorsystem angewendet und führte nach verschiedenen Phasen der Testentwicklung und -optimierung zu einem leistungsfähigen standardisierten Verfahren zur Erfassung der durch Bisphenole induzierten estrogenen Wirkung. Dabei konnte die Sensitivität für wichtige Bisphenole erhöht, und das Ansprechen des Tests auf natürliche und synthetische Estrogene deutlich reduziert werden. Vom natürlichen Estrogen 17 β-Estradiol (E2) muss beispielsweise die Konzentration im Vergleich zu BPA sechsmal höher sein, damit die gleiche biologische Wirkung mit dem A-YBS gemessen wird (Tabelle 1). In biologischen Testsystemen zum Nachweis von estrogener Wirkung, in denen der unmodifizierte Estrogenrezeptor α integriert ist (wie z. B. im A-YES® Assay), muss dagegen nur ca. 1/60 000tel der Konzentration von E2 eingesetzt werden, um die gleiche biologische Wirkung in Bezug auf BPA zu messen.

Fazit

Durch die verbesserte Spezifität für Bisphenol und eine Nachweisgrenze von bis zu 7 µg/l BPA kann z. B. das Migrationsverhalten von Bisphenolen aus Verpackungen und deren Beschichtungen direkt im A-YBS untersucht werden. Die Validität des A-YBS wurde durch eine faktorielle In-house-Validierungsstudie mit realen Proben mit unterschiedlicher Zusammensetzung der Probenmatrix bestätigt. Durch die Verwendung des Hefezellbiosensors in gefriergetrockneter Form beträgt die Testdauer ca. 24 bis 26 Stunden, wobei die reine Arbeitszeit ca. zwei Stunden umfasst. Das Verfahren ist für Deepwell-Platten mit 96 Wells ausgelegt, um maximal 40 Proben mit jeweils zwei Replikaten in einem Durchgang analysieren zu können. Alternativ können weniger Proben in mehreren Verdünnungen oder zusätzlichen Dotierungen untersucht werden. Die Ergebnisse der Analysen werden durch Verwendung von BPA als Referenzstandard als BPAEQ (Bisphenol A-Äquivalentkonzentration) angegeben.

Wirkungsbezogene Verfahren für die Analyse einzelner Stoffe bzw. Stoffgruppen erfahren bislang wenig Beachtung. Sie haben die Eigenschaft, dass alle an der biologischen Wirkung beteiligten Stoffe als Summenparameter erfasst werden, sogar inklusive antagonistischer Wirkungen. Ein solches wirkungsbezogenes, aber auch spezifisches Verfahren ist der A-YBS (Arxula-Yeast Bisphenol Screen), bei dem durch die gezielte Veränderung eines Hefezellbiosensors z.B. aus Lebensmittelverpackungen ausmigrierte Bisphenole gemessen werden. Aktuell werden bei der New Diagnostics GmbH weitere Optimierungen des A-YBS durchgeführt, um die Gesamttestdauer zu verringern und die Nachweisempfindlichkeit gegenüber Bisphenolen weiter zu erhöhen.

AUTOREN
Martin Jähne
new_diagnostics GmbH, Dresden

Dr. Martin Giersberg
IPK Gatersleben, Gatersleben

Referenzen:
[1] Global Bisphenol A Market Report (2018). Analysis 2013-2017 & Forecasts 2018-2023.
[2] Bundesinstitut für Risikobewertung (2010). Fragen und Antworten zu Bisphenol A in verbrauchernahen Produkten. FAQ des BfR vom 12. Oktober 2017.
[3] Böer E, Piontek M, Kunze G Xplor(R) 2 - an optimized transformation/expression system for recombinant protein production in the yeast Arxula adeninivorans. Appl. Microbiol. Biotechnol. 84 (2009).
[4] Rajasärkkä R, Virta M; Characterization of a Bisphenol A Specific Yeast Bioreporter Utilizing the Bisphenol A-Targeted Receptor; Anal. Chem., 2013, 85 (21), pp 10067–10074.

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige

Newsletter bestellen

Immer auf dem Laufenden mit dem LABO Newsletter

Aktuelle Unternehmensnachrichten, Produktnews und Innovationen kostenfrei in Ihrer Mailbox.

AGB und Datenschutz gelesen und bestätigt.
Zur Startseite