Spektroskopie

Matrixeffekte in der LC/MS

Strategien zu ihrer Beherrschung – Teil 1: Reduktion
Die Kopplung von HPLC und Massenspektrometrie hat sich in den letzten Jahren rasant entwickelt und Selektivität und Sensitivität konnten wesentlich verbessert werden. Die Quantifizierung leidet jedoch noch immer unter den Einschränkungen der sogenannten Matrixeffekte. Während eine apparative Universallösung derzeit noch aussteht, werden hier einige Gegenstrategien angeführt.

Selbst die höchste Selektivität moderner Massenspektrometer ist machtlos gegen die hier beschriebenen Matrixeffekte. Sie können zwar die Matrix perfekt ausblenden, so dass sie nicht mehr sichtbar ist und die Auswertung der Chromatogramme nicht mehr gestört wird. Der gefürchtete Einfluss der Matrixbestandteile auf die Quantifizierung bleibt jedoch bestehen, denn er beginnt schon vor dem hochselektiven Massenanalysator, nämlich in der Ionenquelle. Alle Ionisationsstörungen, die hier ablaufen, können apparativ nicht mehr wettgemacht werden.

Matrixeffekte sind hier definiert als die Änderung des MS-Signals eines Analyten durch koeluierende Matrixkomponenten einer Probe, im Vergleich zur Injektion des Analyten in reinem Lösungsmittel. D.h. die simultan in der Ionenquelle vorhandenen Störstoffe der Probe verändern die Bedingungen der Ionisation. Die im Folgenden beschriebenen Mechanismen in der Elektrospray-Ionenquelle (ESI) werden durch simultan eluierende Matrixbestandteile gestört: Die Tröpfchen des aus dem zerstäubten Eluenten gebildeten Nebels weisen anfänglich einen Radius von ca. 1…3 µm auf. Dabei verteilen sich ca. 50 000 Einzelladungen gleichmäßig über die jeweilige Tröpfchenoberfläche. Durch die stattfindende Lösungsmittelverdampfung, welche durch die Zufuhr von Wärme beschleunigt wird, verringert sich der Radius dieser Tröpfchen immer weiter, bis die elektrostatischen Coulomb-Abstoßungskräfte zwischen den gleichgeladenen Ionen größer sind als die kohäsiven Kräfte des Lösungsmittels (die notwendige Ladung für einen solchen Prozess ist von der Oberflächenspannung des Lösungsmittels und dem Tröpfchenradius abhängig und kann nach der Rayleigh-Gleichung berechnet werden). Ist das sog. Rayleigh-Limit erreicht, kommt es in einer sogenannten Coulomb-Explosion schließlich zur Spaltung der Ausgangströpfchen (Parent droplets) in kleinere Tröpfchen (Offspring droplets), deren Radius ungefähr um eine Zehnerpotenz reduziert wird. Es folgen weitere Kaskaden von Aufspaltungen bis letztlich die „nackten“ Ionen vorliegen.

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Konkurrenz um Ladungsträger

Die wichtigste Störung bei Realproben ist, dass die Matrixbestandteile mit den Zielanalyten um die zur Verfügung stehenden limitierten Oberflächenladungen in Konkurrenz treten und z.B. durch eine Unterdrückung der Ionenbildung („Ion Suppression“) zu Mindergehalten führen. Sie verändern aber auch die Oberflächenspannung der ESI-Tröpfchen und haben damit Einfluss auf die Coulomb-Explosionen [1]. Oder sie bilden mit den Zielanalyten unerwünschte Addukte, wobei auch andere Ionen entstehen können (z.B. [M + Na]+) als bei der Kalibrierung mit reinem Lösungsmittel ([M + H]+). Im Vergleich zur externen Kalibrierung in reinem Lösungsmittel führen die Matrixeffekte dann bei matrixbelasteten Proben je nach Koelution störender Bestandteile teilweise zu gravierenden Fehlquantifizierungen. Stellt man die Kalibrierfunktionen mit diversen Matrizes jener ohne Matrixbeteiligung (d.h. Standards in reinem Lösungsmittel) gegenüber, erhält man Kurven wie in Bild 1 (zB; Ionensuppression bei ESI; schematische Darstellung). Während die Matrix A nur einen geringen Einfluss auf die Ionisation ausübt, zeigen die Störstoffe von C (rot) eine starke Unterdrückung der Ionenbildung des Zielanalyten. Der Quotient der Kalibrierkurvensteigungen, bezogen auf die Steigung mit reinem Lösungsmittel, (schwarz) entspricht dem der jeweiligen Matrix. Die Abhängigkeit des Effektes von der Konzentration der Probenmatrix in der Messlösung ist schematisch in blau (B) dargestellt.

Diese Beeinträchtigungen treten nicht nur bei ESI, sondern auch bei den Ionisationstechniken Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) und angeblich seltener bei Atmospheric Pressure Photoionization (APPI) auf [2]. Während ESI sehr anfällig auf „Ion Suppression“ ist, wird bei APCI oft über Signalerhöhungen („Ion Enhancement“) geklagt. Für alle Ionisationstechniken gilt, dass die unerwünschten Effekte primär von der Matrix abhängig sind, das Ausmaß in manchen Fällen aber auch zwischen den Analyten differieren kann. Oft sind auch nur bestimmte Chromatogrammbereiche stark betroffen – diese entsprechen den Elutionsbereichen der Hauptanteile der Störstoffe. Durch konstante Infundierung einer Standardlösung eines Zielanalyten in den LC-Eluentenstrom einer (analytfreien) Probenmatrix vor der Ionenquelle lassen sich solche Störbereiche identifizieren (permanente Nachsäulen-Infusion; Bild 2).

Teil A in Bild 3 zeigt die unterschiedlichen Abweichungen des MS-Signals über den Elutionsbereich in Form von Matrixeffekt-Profilen für zwei Analyten. Dort wo das Signal, das durch den zudosierten Analyten konstant bleiben sollte, zeitweise einbricht, zeigen sich die klassischen „Ion Suppression“-Zonen im Chromatogramm. Die Arbeitsgruppe um Lutz Alder (BfR) hat an zwei Pestiziden demonstriert, dass je nach Retentionszeit der Analyten stark unterschiedliche Signalunterdrückungen auftreten. Im Vergleich zu den Standards in reinem Lösungsmittel (Bild 3 B unten) wird unter Matrixeinfluss Analyt B um 20 % gedämpft, während Analyt A sogar 80 % seiner Signalstärke durch simultan eluierende Störstoffe einbüßt (Bild 3 B) [3].

Reduktion oder Kompensation

Als Gegenstrategie gilt es, entweder die Matrixeffekte zu reduzieren (Teil 1) oder deren Auswirkungen zu kompensieren (siehe Teil 2 dieses Artikels). Die Reduktions-Strategie wird z.B. von der amerikanischen Food and Drug Administration FDA bevorzugt (Center for Drug Evaluation and Research CDER bzw. Center for Veterinary Medicine CVM), während die europäischen Behörden auf Kompensation setzen (European Union, DG SANCO Guidance document No. SANCO/2007/3131).

Die wichtigsten Möglichkeiten beider Maßnahmen werden im Folgenden mit ihren Vor- und Nachteilen aufgezeigt. Die teure Technik der LC/MS (-MS) kann oft nur wirtschaftlich eingesetzt werden, wenn sich dadurch gleich mehrere Einzelmethoden ersetzen lassen. Daher sollen diese Strategien auch auf ihre Eignung für Multianalysen geprüft werden.

Als Reduktionsmaßnahmen stehen zur Verfügung: Clean up, Chromatographische Trennung, Verdünnung der Probe.


Cleanup

Ziel ist die extreme Diskriminierung von Störstoffen durch spezielle Reinigungsverfahren bei der Probenaufbereitung. Je stärker der Reinigungseffekt ist, desto geringer fallen die Matrixeffekte aus.

Ausgearbeitete Cleanup-Verfahren für klassische HPLC-Methoden können meist direkt beim Transfer für die LC-MS angewendet werden. So sind relativ unspezifische Cleanup-Verfahren wie die Gel-Permeations-Chromatographie (GPC) und die Solid Phase Extraction (SPE) zwar universell anwendbar, aber nicht sehr selektiv. Störstoffe können durch hochspezifische Reinigungsmethoden mit Immunoaffinitätssäulen (IAC) oder Molecular Imprinted Polymers (MIP) am effektivsten eliminiert werden. Im selben Maße reduziert sich jedoch auch die Eignung für Multimethoden, denn hohe Reinigungsselektivität und Eignung für ein sehr breites Analytenspektrum schließen sich in der Praxis meist aus.
In der Pestizidanalytik hat sich die sog. QuEChERS-Methode (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe) als kostengünstiger Kompromiss durchgesetzt.

Allen Cleanup-Verfahren gemeinsam sind folgende Nachteile:

 Hohe Materialkosten bei SPE und IAC bzw. Apparatekosten bei GPC.
 Arbeitsintensiv (--> Personalkosten).
 Gefahr von Analytverlusten (unvollständige Rückgewinnungsraten).
 Verdünnung der Probe erfordert aufwendiges Rekonzentrieren.
 Oft kein gemeinsames Clean up für Multimethoden verfügbar.


Chromatographische Trennung

Ziel ist die verbesserte chromatographische Separierung der störenden Matrixbestandteile von den eluierenden Zielanalyten. Das kann z.B. durch optimierte Gradientenelution bzw. durch 2-dimensionale HPLC erreicht werden. Der erforderliche Optimierungsaufwand sollte bei erfolgreicher Abtrennung der Störsubstanzen gerechtfertigt sein.

Ebenso wird sich der technische Mehraufwand für die LC-Säulenschaltung (2D) bei hohen Probenzahlen rechnen. Die oft dafür propagierte, höher auflösende LC mit Partikelgrößen <2 µm (sog. UHPLC, UPLC, RR-HPLC, etc.) scheint dafür auch nicht der Weisheit letzter Schluss zu sein. Denn die Vielzahl von Störstoffen in ungereinigten Rohextrakten ist bei Rückstandsanalysen noch dazu in vergleichsweise riesigen Konzentrationen neben den Zielanalyten vorhanden. Sie verteilen bzw. „verschmieren“ sich über breite Elutionsbereiche. In manchen Fällen mag es gelingen, einige Zielanalyten in störungsfreien Zonen „unterzubringen“, bei komplexen Multimethoden ist es jedoch schon schwierig, alle Analyten in einem Chromatogramm ausreichend gut aufzuteilen. In solchen Fällen kann eine chromatographische Abtrennung zahlreicher Matrixbestandteile von den vielen Zielanalyten nicht vollständig gelingen.


Verdünnung der Probe

Die Verdünnung der Messlösung reduziert die Konzentrationen der Störsubstanzen in der Ionenquelle und damit auch die Matrixeffekte. Sie ist das charakteristische Merkmal des sog. „Dilute & Shoot“-Ansatzes. Nach Lutz Alder kann als grober Anhaltspunkt davon ausgegangen werden, dass sich bei einer 1:10-Verdünnung die Matrixeffekte um ca. ein Drittel und erst bei 1:100 um rund zwei Drittel reduzieren. Völlig vernachlässigbar wären Matrixeffekte demnach erst bei ca. 1000-facher Verdünnung (es wird ein logarithmischer Zusammenhang angenommen) [4].

Die gravierenden Empfindlichkeitsverluste erlauben diese Verdünnungsvariante aber nur bei Proben mit ausreichend hohen Konzentrationen. Für die Rückstandsanalytik sind höchst empfindliche und damit sehr teure Massenspektrometer erforderlich. In Kombination mit anderen Gegenmaßnahmen kann diese Methode aber unterstützend helfen, Matrixeffekte auf ein erträgliches Maß zu reduzieren.

Wolfgang Brodacz*)

  1. AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit, Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik, Linz, E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at.


Literatur

  1. W. Brodacz, „Elektrospray-Ionisation. Die „sprühende“ Verbindung zwischen LC und MS“; Chemiereport.at 4/2009; S 44-45; Juni 2009.
  2. W. Brodacz, „LC/MS-Ionisationstechniken mit Coronaentladung und Photonen“; Chemiereport.at 5/2009; S 52-53; August 2009.
  3. H. Stahnke, T. Reemtsma, and L. Alder; „Compensation of Matrix Effects by Postcolumn Infusion of a Monitor Substance in Multiresidue Analysis with LC-MS/MS“; Anal. Chem. 2009, 81, 2185-2192.
  4. H. Stahnke, L. Alder and T. Reemtsma, 45th Florida Pesticide Residue Workshop, July 22 2008.
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