Screening von Biopharmazeutika

Strukturveränderungen mit Hochdurchsatz-CD-Spektroskopie erkennen

Die Messung des Zirkulardichroismus (circular dichroism, CD) ist eine etablierte Methode zur Untersuchung der Struktur und von Strukturänderungen von Biopolymeren wie Proteinen und Nukleinsäuren. CD-Messungen sind unter Variation von verschiedensten Umgebungsparametern wie pH-Wert, Temperatur oder Magnetfeldern möglich. Zudem werden recht geringe Probenmengen und keine aufwendige Probenvorbereitung benötigt.

Biopharmazeutische Wirkstoffe haben in den letzten Jahren ihren Marktanteil stark erhöht. Aufgrund ihrer hohen Spezifität des Wirkungsbereiches zeigen sie üblicherweise geringe Nebenwirkungen. Allerdings ist die Wirksamkeit stark von der korrekten Struktur der eingesetzten Antikörper oder Nukleinsäuren abhängig, welche wiederum sensitiv auf die Art der Formulierung und Temperatur ist. Hier ist die CD-Spektroskopie ein sehr hilfreiches Tool zur Kontrolle der Struktur von Biopharmazeutika sowie der Untersuchung von Biosimilars, da CD-Spektren sehr sensitiv auf Strukturänderungen sind.

Anwendungsbeispiel

In der Screening-Phase neuer Wirkstoffe müssen eine Vielzahl von Variationen bezüglich Wirkstoff und Formulierung überprüft werden, was ein zeitaufwendiger Prozess mit vielen Messungen ist. Für ein solches Hochdurchsatz(High-throughput, HT)-Screening eignet sich die Kombination eines CD-Spektrometers mit einem Autosampler-System und einer Durchflusszelle, wie das „HTCDPlus“-System von Jasco (Bild 1). Damit können bis zu 192 Proben vollautomatisiert gemessen werden. Zwischen den Messungen wird die Durchflusszelle mit bis zu drei Waschlösungen gereinigt, und anschließend werden Messzelle und Transferbereich getrocknet, um Verdünnungseffekte zu vermeiden.

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Bild 1: J-1500 CD-Spektrometer von Jasco mit dem Hochdurchsatzsystem „HTCDPlus“. © JASCO Corporation

VHH-Antikörper sind kleine und variable Domänen von Schwerketten-Antikörpern, welche hauptsächlich in der Familie der Kamele vorkommen. Ihre Bindungsspezifizität und Stabilität gegenüber pH- und Temperaturänderungen machen sie zu einem attraktiven Ziel in der Wirkstoff-Forschung. Zudem sind sie leicht zu modifizieren und aufgrund ihrer kleinen Größe von etwa 15 kDa gut im Großmaßstab industriell herstellbar.

Da sich die Struktur von Antikörpern in Abhängigkeit der Formulierung und Lagerung ändern kann, sind Stabilitätsuntersuchungen ein wichtiges Mittel für die Qualitätssicherung. Häufig wird die Stabilität sowie das reversible Zurückfalten nach Denaturierung über eine thermische Denaturierung bestimmt. Eine solche Messung ist sehr langwierig. Eine Alternative ist ein primäres Screening über die Veränderung des CD-Spektrums unter verschiedenen Formulierungsbedingungen.

Dazu wurde ein Referenz-CD-Spektrum durch zehn Probemessungen eines VHH-Antikörpers bei pH 7 und in 200 mM NaCl in einer Durchflussküvette mit 0,2 mm Pfadlänge gemessen. Dieses Referenzspektrum wird mit der Z-Score-Methode mit den Spektren bei unterschiedlichem pH-Wert und Salzkonzentration verglichen. Der Z-Score wird aus dem Referenzspektrum μ, der Standardabweichung б und dem Korrelationskoeffizienten zwischen Probe- und Referenzspektrum berechnet: Z-Score = (μ–R)/б.

Bild 2: Auftragung von Z-Score in Abhängigkeit von pH-Wert und NaCl-Konzentration für VHH-Antikörper. © JASCO Corporation

Der Z-Sore beschreibt, um wie viele Standardabweichungen das gemessene Spektrum von dem Referenzspektrum abweicht, wobei ein Wert größer als 2 als signifikante Abweichung festgelegt wurde. Für die VHH-Antikörper ist das Ergebnis der Berechnung in Abhängigkeit von pH und Salzkonzentration in Bild 2 gezeigt. Es ist ersichtlich, dass die Struktur zwischen pH 6 und 9 sich nicht signifikant von der Struktur bei pH 7 und 200 mM NaCl unterscheidet. Für pH-Werte kleiner als 6 und größer als 9 ist der Z-Score groß, die Struktur der VHH-Antikörper verändert. Dieser Effekt verstärkt sich bei hohen NaCl-Konzentrationen.

Bild 3: Abhängigkeit des Z-Scores von der Denaturierungstemperatur von VHH-Antikörpern. © JASCO Corporation

Die Stabilität von Biomolekülen hängt stark mit deren Struktur zusammen. Falsch gefaltete Proteine zeigen eine niedrigere Denaturierungstemperatur. Die Messung einer Schmelzkurve ist daher ein wichtiges Werkzeug zur Messung der Stabilität von Biomolekülen. Da diese Messung ist ein recht zeitintensiver Prozess ist, sind nur wenige Probenmessungen wünschenswert. Für die VHH- Antikörper wurden ebenfalls die Schmelztemperaturen mit einem Peltier-Sechsfach-Wechsler an einem Jasco-J-1500-CD-Spektrometer bestimmt und mit den aus den Spektren erhaltenen Z-Scores verglichen. Es besteht eine gute Korrelation (R² = 0,91) zwischen Z-Score und Schmelzpunkt: je höher der Z-Score, desto niedriger die Denaturierungstemperatur und damit die Stabilität (s. Bild 3). Die Messung des CD-Spektrums mittels Hochdurchsatz-CD-Spektroskopie und Bestimmung des Z-Scores ist daher eine gute Alternative für ein primäres Screening, bevor aussichtsreiche Kandidaten einer Schmelzpunktanalyse unterzogen werden.

Sekundär- und Tertiärstruktur messen

Bild 4: CD-Spektren von Lysozym. Sekundärstrukturbereich 260–185 nm mit 1 mm Pfadlänge, Tertiärstrukturbereich 320–250 nm, mit 10 mm Pfadlänge. Oben rechts: Verwendete Durchflussküvette („3 in 1“; Typ 176.765 von Hellma Analytics). © JASCO Corporation

Soll neben der Sekundärstruktur auch die Tertiärstruktur von Proteinen analysiert werden, muss das CD-Spektrum bei höheren Konzentrationen und mit größeren Schichtdicken gemessen werden. Um ein häufiges Umstecken der Schlauchverbindungen an verschiedene Küvetten zu vermeiden, kann eine „3 in 1“-Durchflussküvette mit zwei verschiedenen integrierten Pfadlängen verwendet werden. Dazu muss die Küvette nur um 90° im Probenraum des Spektrometers gedreht werden, das Wechseln der Anschlüsse und damit das Risiko für Undichtigkeiten entfällt. So erhaltene Spektren von Lysozym sind in Bild 4 gezeigt. Diese zeigen eine gute Reproduzierbarkeit des Systems. Die Verwendung einer solchen Küvette erleichtert die Arbeit, wenn Strukturänderungen sowohl im Sekundär- als auch Tertiärstrukturbereich untersucht werden sollen.

Zusammenfassung

Die Hochdurchsatz-CD-Spektroskopie ist eine leistungsfähige Methode zum primären Wirkstoffscreening. Kombiniert mit einer statistischen Z-Score-Analyse und einer „3 in 1“-Durchflussküvette kann eine Vielzahl von Biopharmazeutika auf ihre Strukturstabilität hin untersucht werden. Für VHH-Antikörper erhält man eine hohe Korrelation zwischen Z-Score und Schmelztemperatur, was die Eignung der Methode als Alternative zur Bestimmung der thermischen Stabilität zeigt.

Referenz:

[1] Evaluation of VHH antibody stability using high-throughput CD system, Application Note 200-CD-0034, JASCO Corporation, Tokyo, Japan; www.jasco-global.com/solutions/evaluation-of-vhh-antibody-stability-using-high-throughput-cd-system

AUTOR
Dr. Christian Spies
JASCO Deutschland, Pfungstadt
Tel.: 06157/80890-0
info@jasco.de
www.jasco.de

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