Fachbeitrag

Massenspektrometrie in der Labormedizin

in der Labormedizin
Bild 1: Funktionseinheiten eines Massenspektrometers.

Dr. Thomas Plecko*)

  1. Zentralinstitut für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin, Klinikum Stuttgart, Kriegsbergstr. 60, 70174 Stuttgart. E-Mail: t.plecko@klinikum-stuttgart.de.
Die Detektion von Analyten mittels Massenspektrometrie (MS) nach chromatographischer Trennung (GC, LC) gewinnt in der Labormedizin zunehmend an Bedeutung. Die entsprechenden Kopplungstechniken (GC-MS, LC-MS oder LC-MS/MS) werden unter anderem zur Drogenanalytik, Medikamenten-Monitoring und Neugeborenen-Screening auf angeborene metabolische und endokrine Störungen eingesetzt.


Die Massenspektrometrie stellt ein physikalisches Verfahren dar, bei dem im Vakuum stabile Ionen nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z) getrennt werden. Der Durchbruch als wichtige Analysenmethode der relativ alten Methode (J.J. Thomson, 1910) in der organischen Chemie gelang erst gegen 1960. Durch die rasche Weiterentwicklung und apparative Miniaturisierung der vergangenen zehn Jahre hat diese Methodik auch zunehmend ihren Platz im medizinischen Labor gefunden. Durch die niedrigen Nachweisgrenzen wird das Massenspektrometer als Detektor für Gas- und Flüssigkeitschromatographen verwendet.

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Der Einsatz eines Massenspektrometers zeichnet sich aus durch:

  • Hohe Richtigkeit.
    • Hohe Präzision.
    • Hohe Spezifität.
    • Niedrige Nachweisgrenze.

Im Folgenden kann die Vielzahl und Komplexizität der verschiedenen Verfahren nur angerissen werden, deswegen wird verstärkt auf den Einsatz der Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) eingegangen. Die GC-MS findet Anwendung beim Drogen-Screening aus Urin und Blut und Aufklärungen von Vergiftungen.

Prinzip und Aufbau

Generell lässt sich ein Massenspektrometer in vier Funktionseinheiten unterteilen (Bild 1): Probenzuführung, Ionenerzeugung, Massentrennung und Ionennachweis. Es muss im Hochvakuum gearbeitet werden, um unfreiwillige Zusammenstöße zwischen den gebildeten Ionen und Molekülen oder Atomen zu vermeiden. Die zu untersuchende Substanz wird durch geeignete Verfahren ionisiert. Die erhalten Ionen werden dann aufgrund ihres Verhältnisses von Masse zu Ladung (m/z) aufgetrennt und registriert.

Die Probenzuführung erfolgt bei medizinisch-diagnostischen Anwendungen direkt über einen gekoppelten Gas- (GC) oder Flüssigkeitschromatographen (LC, HPLC), in dem die einzelnen Probenbestandteile in möglichst reine Fraktionen aufgetrennt werden.

Weiterhin besteht auch die Möglichkeit, eine Probe direkt in das Massenspektrometer einzubringen. Zur Analyse leicht flüchtiger Analyten wie z.B. Ethanol, Ethylenglycol etc. wird die so genannte Headspace-Analyse verwendet. Hierbei lässt man die zu untersuchende Probe in einem geschlossenem Gefäß bei kontrollierter Temperatur in ein Gleichgewicht mit der Gasphase kommen. Der zu untersuchende Analyt liegt nach einiger Zeit in ausreichender Konzentration in der Gasphase vor. Aus dieser wird dann ein bestimmtes Volumen direkt in das GC-Interface des Massenspektrometers eingebracht. Zum Einsatz kommt dieses Verfahren z.B. bei der gerichtsverwertbaren Ermittlung der Blutalkohol-Konzentration.

Die wichtigsten Ionisationsarten sind Bild 1 zu entnehmen. Nach Probentrennung durch einen Gaschromatographen wird als Ionisierungsart die Elektronenstoßionisation oder die chemische Ionisation verwendet.

Da die Elektronenstoßionisation (EI, engl. Electron impact ionisation) die gebräuchlichste Art der Ionenerzeugung darstellt, soll diese im Folgenden näher beschrieben werden: Die gasförmige Probe wird in der Ionenquelle mit einem Elektronenstrahl der kinetischen Energie von 70...100 eV beschossen. Die Elektronen treffen senkrecht auf den eingebrachten Molekülstrahl. Durch diese Stoßionisation entstehen in der Hauptsache Radikal-Kationen M+• (siehe Bild 2). Bei diesen kommt es in der Folge zu zahlreichen Bindungsbrüchen auch durch Zusammenprall mit anderen Teilchen. Man erhält somit komplexe Massenspektren mit einer Vielzahl an Tochterionen (Molekülfragmente), aber nur sehr wenigen oder fast keinen Mutterionen M+•. Die dadurch erhalten Ionen und ionischen Fragmente ergeben nach Massentrennung ein für jede Substanz charakteristisches Muster, vergleichbar mit einem Fingerabdruck.

Bei der chemischen Ionisation (CI) wird ein entsprechendes Reaktand-Gas (zum Beispiel Methan) durch Elektronenstoß ionisiert. Diese Reaktand-Ionen reagieren dann mit der zu untersuchenden Probe, was zu einem Protonenübergang führt. Die CI ist sehr viel schonender als die EI und zählt zu den weichen Ionisierungsarten.

Um nichtflüchtige und höher molekulare organische oder biochemische Moleküle sowie ein HPLC-Eluat zu ionisieren, muss man auf andere als die oben beschriebenen Ionisationsarten zurückgreifen. Man bedient sich hierbei der Ionisierung mittels Desorptionsquellen, um die mobilen Phasen der Flüssigkeitschromatographie zu entfernen. Der Vollständigkeit halber sollen diese Verfahren erwähnt werden. Dazu zählen FAB (Fast Atom Bombardement), FD (Felddesorption), MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation). Als wichtigstes Ionisierungsverfahren für die HPLC/MS-Kopplung ist das ESI-Verfahren (Electrospray-Interfaces) zu nennen, bei welchem die Ionisierung unter Atmosphärendruck erfolgt. Das ESI-Verfahren ist für unpolare Substanzgruppen ungeeignet; um diese zu untersuchen, wird das verwandte APCI-Verfahren (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) eingesetzt.

Massentrennung

Die einfachste Art der Ionentrennung kann mit der Magnetfeld-Sektorfeld-Fokussierung erreicht werden. Die gebildeten Ionen werden im elektromagnetischen Feld der Größenordnung 1 Tesla nach ihrer Masse aufgetrennt. Die Teilchen gleicher Ladung erfahren eine massenabhängige Flugbahnablenkung. Teilchen geringerer Masse werden stärker abgelenkt als schwerere Teilchen.

Die häufigste Methode zur Massentrennung ist der Einsatz eines Quadrupol-Massenfilters, welcher als preisgünstige und robuste Detektionseinheit für vorausgehend gekoppelte Chromatographiesysteme (LC, GC) Verwendung findet. Ein Quadrupol-Massenfilter ist aus vier gegenüberliegenden, parallel zueinander angeordneten Stab-Elektroden aufgebaut. An diese wird paarweise eine variable und jeweils entgegengesetzt gepolte Gleichspannungsquelle angeschlossen. Damit nur Ionen gleicher Masse den Quadrupol passieren können, wird eine modulierbare Hochspannungsfrequenz überlagert (siehe Bild 3).

Durch den Einsatz eines Quadrupols sind zwei Messtechniken gegeben: der „Full-Scan“- und der „Selected Ion Monitoring (SIM)“-Modus. Im Full-Scan-Modus wird kontinuierlich ein bestimmter Massenbereich registriert. Dadurch werden alle in diesem Bereich gebildeten Ionen detektiert. Im SIM-Modus werden nur wenige vorgegebene Ionen mit entsprechendem Verhältnis Masse/Ladung durch den Quadrupol gelassen und detektiert. Dies führt im Gegensatz zum Full-Scan-Modus zu einer Erhöhung der Nachweisgrenze (Sensitivität).
Eine weitere Methode der Massentrennung, welche ebenfalls in der GC/MS-Kopplung eingesetzt wird, ist die Ionenfalle, welche eine Weiterentwicklung des Quadrupolmassenfilters darstellt. In einer Ionenfalle können die ausgewählten Ionen ohne Wandstöße eingeschlossen werden. Auch hier kann, analog zum Quadrupol, mit zwei unterschiedlichen Modi gearbeitet werden. Im ersten Fall können ausschließlich die Ionen eines bestimmten m/z-Verhältnisses „gefangen“ und dann ausgeschleust und detektiert werden. Im zweiten Fall werden alle Ionen nach ihrem m/z-Verhältnis getrennt und dann sukzessive ausgeschleust.

Weiterhin zu erwähnen sind noch so genannte Flugzeit-Massenspektrometer (TOF: Time-Of-Flight), bei denen man sich die unterschiedliche Geschwindigkeit und die daraus resultierende Flugzeit der Ionen zu Nutze macht. Leichte Ionen „fliegen“ schneller als schwere und passieren demnach eine bestimmte Strecke schneller.

Der Einsatz von sogenannten Tandem-Massenspektrometern (MS/MS) führt zu einer entscheidenden Verbesserung der Nachweisgrenze. Von der Vielzahl der möglichen Kombinationen sind die „Triplequads“ (Hintereinanderschaltung von drei Quadrupolen) die am weitesten verbreitete MS/MS-Variante.

Anwendungsbeispiel

Eines der Haupteinsatzgebiete der Massenspektrometrie in der Biomedizin findet sich im Bereich der Toxikologie – so etwa bei der Untersuchung von Urinproben auf Drogenmissbrauch und bei Verdacht auf eine akute Intoxikation. Verwendung findet hier in der Regel ein Gaschromatograph zur Substanzauftrennung mit einem gekoppelten Massenspektrometer zur Substanzidentifikation. Das Probenmaterial kann hier nicht nativ in den Gaschromatographen eingebracht werden. Zur Abtrennung der Probenmatrix muss man die Probe vielmehr zunächst extrahieren. Anschließend erfolgt eine Derivatisierung zur besseren Identifikation. Diese ist notwendig um die gaschromatographischen Eigenschaften der polaren Substanzen entscheidend zu verbessern (Flüchtigkeit, thermische Stabilität). Weiterhin werden durch die Derivatisierung (Acetylierung, Trimethylsilylierung) die Massenspektren der entsprechenden Substanzen geändert, um mehrere typische Ionen zu erhalten.

In den Bildern 4 und 5 sind die acetylierten Massenspektrogramme von Paracetamol und Heroin abgebildet. Diese wurden massenspektrometrisch mit Elektronenstoßionisation und einem Quadrupol-Massenfilter im Full-Scan-Modus identifiziert.
Eine Übersicht der gebräuchlichsten Anwendungen der Massenspektrometrie in der Laboratoriumsmedizin ist Tabelle 1 zu entnehmen.

Literatur

  1. Camman C. (Hrsg.): Instrumentelle Analytische Chemie, 2001 Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg – Berlin.
  2. Hesse M., Meier H., Zeeh B.: Spektroskopische Methoden in der organischen Chemie, 1995 Thieme Verlag, Stuttgart – New York.
  3. Fiedler G.M.: Anwendungsbeispiele der Massenspektrometrie in der Klinischen Chemie und Laboratoriumsmedizin, J Lab Med 2004;28(3):185-194.
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