Triple-Quadrupol-Massenspektrometer

Teil- 2: Steigerung der Selektivität

Neben der Sensitivität ist die Selektivität der wichtigste Punkt im Pflichtenheft eines LC-MS/MSSystems. Obwohl die Tandem-Funktionen der Triple-Quadrupol-Geräte schon beste Voraussetzungen dafür bieten, haben die Hersteller weitere Funktionalitäten entwickelt, um dieses Kriterium zu verbessern. Denn gerade bei hochempfindlicher Betriebsweise ist es entscheidend, dass die Vielzahl an Störsignalen erfolgreich unterdrückt werden kann. Verschiedene technische Ansätze wie "MRM3", DMS, etc. steigern damit wiederum das für die Sensitivität so entscheidende Signal-zu-Rausch-Verhältnis (S/N).

MRM3
Die Firma AB SCIEX kombiniert die Funktion von Quadrupol und 3D-Ionenfalle in Form der linearen Iontrap (LIT) mit der Bezeichnung "QTRAP". Eine verbesserte Version ("Linear Accelerator Trap") soll im Ionenfallen-Modus die Sensitivität um den Faktor 10 ... 100 steigern können und beschleunigte "MRM3"-Experimente (MS3) erlauben (Bild 1). Dafür wird gezielt Stoßgas in der QTRAP dazudosiert (Bild 2) und eine zweite Fragmentierung vollzogen, so dass auch das Product-Ion gespaltet werden kann.

Im Idealfall lassen sich mit diesem zweiten Massenübergang (M1 > M2 > M3) störende Matrixsignale noch besser unterdrücken. Obwohl die absolute Signalintensität im Vergleich zu MRM oft absinken kann, soll das entscheidende S/N gesteigert werden. MRM3 ist meist nur dann zweckmäßig, wenn der übliche MRM-Übergang durch sichtbare Matrixpeaks oder großes Rauschen überlagert wird.

Differentielle Ionenmobilitäts-Spektrometrie
Die differentielle Ionenmobilitäts-Spektrometrie (DMS) trennt Ionen aufgrund ihrer unterschiedlichen Mobilität unter dem Einfluss eines elektrischen Wechselfeldes (D. Volmer: "Selektivitätsgewinn bei der Analytik biologischer Proben"; GIT 12/2012; S. 855- 857). Da sie bei Atmosphärendruck arbeitet, kann sie eigenständig oder in Kopplung mit chromatographischen Trenntechniken (z.B. GC-DMS) verwendet werden. Besonders interessant wird sie jedoch als Kopplungsvariante mit der Massenspektrometrie.

Als orthogonale Gasphasentrenntechnik zwischen HPLC und Massenspektrometer positioniert, kann DMS helfen, isobare und isomere Analyten zu trennen und damit noch mehr Selektivität in ein LC-MS zu bringen (LC-DMS-MS/MS).

Bei der klassischen Ionenmobilitäts-Spektrometrie (IMS) wandern die in einer üblichen Ionenquelle erzeugten Ionen in einer sogenannten Driftzelle gegen einen Gasstrom. Angetrieben werden sie dabei von einem elektrischen Feld mit der Feldstärke E. Ihre Geschwindigkeit bzw. die Wegzeit in der Driftzelle sind dabei unter anderem von der Masse, der Ladung und insbesondere von der Struktur der Analytionen abhängig. Die Geschwindigkeit verhält sich dabei proportional zum Produkt aus Feldstärke E und dem substanzspezifischen Ionenmobilitätskoeffizienten K. Wichtig ist, dass K von der Form bzw. dem Querschnitt des driftenden Ions abhängig ist. Bei der differenziellen Ionenmobilitätsspektrometrie wird zusätzlich die Feldabhängigkeit von K ausgenutzt. Der DMS-Analysator besteht im Wesentlichen aus zwei parallelen Elektroden, an die eine asymmetrische Wechselspannung quer zum Transportgasfluss angelegt wird (Bild 3, rechts unten). Eine Wechselspannung erzeugt ein elektrisches Wechselfeld mit alternierenden starken und schwachen Phasen (Bild 3, Mitte rechts, grün). DMS ist ein zusätzliches Trennglied, das aufgrund eines anderen Trennprinzips die Gesamtselektivität erhöht.

Um im komplexen Wechselspiel der elektrischen Felder ein erwünschtes Zielion nicht an den Elektroden zu "verlieren", muss es durch eine sog. "Compensation Voltage" (CV) immer wieder in das Zentrum des DMS-Ionenfilters "zurückgezogen" werden.

Als nachrüstbares Modul zwischen Ionenquelle und Massenanalysator ist eine DMS unter den Begriffen "FAIMS" (Thermo Scientific) bzw. "SelexION" (AB SCIEX) kommerziell erhältlich.

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Bild 1: Sog. „MRM3“-Experiment durch weitere Fragmentierung in der LIT. (© AB SCIEX)

FAIMS
Thermo Fisher Scientific versucht mit der FAIMS-Technologie (high- Field Asymmetric waveform Ion Mobility Spectrometry) störende Matrixfragmente nach der Ionenquelle auszugrenzen. Die gezielte Nutzung der unterschiedlichen Ionenmobilitäten ermöglicht die Differenzierung von isobaren Ionen (gleiches Verhältnis von Masse-zu-Ladung), sofern sie sich in ihren Strukturen unterscheiden. Die FAIMS-Hardware wird zwischen Ionenquelle und Transferkapillare montiert und ist bei Geräten von Thermo Fisher Scientific nachrüstbar. Bei FAIMS wird die Driftregion durch zylinderförmige Elektroden gebildet (Bild 3, oben). Durch Anlegen spezieller Waveform-Spannungen (grün) zwischen innerer u. äußerer Elektrode gelingt nur den Analyten mit gleichem K-Wert (rot) die Passage durch FAIMS (Bild 3, rechts unten). Bild 4 zeigt die erwünschte Diskriminierung von isobaren Störsubstanzen durch FAIMS.

SelexION
Ähnlich, in Details aber modifiziert, funktioniert das Ionenmobilitäts-Zubehör "SelexION" der Firma AB SCIEX. Diese Technologie ist für die High-End Triple-Quadrupole- und QTRAP-Systeme 5500 und 6500 (sowie TripleTOF 5600+) konzipiert und dient, wie der Name andeutet, der Selektion von Ionen, die sich weder durch HPLC-Bedingungen noch durch MS-MS-Fragmentierungen ausreichend unterscheiden lassen. Besonders bei bestimmten Matrixproblemen kann diese Technik hilfreich sein, da die zusätzliche Selektivität auch dazu eingesetzt werden kann, Precursor-Ionen vom chemischen Untergrund abzutrennen. In solchen Fällen soll das Signal-Rausch-Verhältnis nach Aussage von AB SCIEX um eine Zehnerpotenz verbessert werden können. Es werden einfache Bedienbarkeit, Robustheit und hohe Geschwindigkeit des Selektionsmechanismus versprochen.

Das SelexION-Modul hat eine planare Ausführung mit nur 30 mm Stärke und gewährleistet daher kurze Verweilzeiten, so dass es mit den beliebten MRM-Multi-Quantifizierungsmethoden und der UHPLC kompatibel ist. Es kann ohne Werkzeug in wenigen Minuten hinter der Ionisierungsquelle und vor das Orifice des Instrumentes eingebaut und ebenso schnell wieder entfernt werden (Bild 5). Für maximale Flexibilität kann das Element auch im eingebauten Zustand im Durchflussmodus, also ohne dass die Ionenmobilitätstrennung aktiviert ist, verwendet werden.

Um eine gewünschte Substanz zu selektieren, ist ein eigenes Tuning erforderlich. Das SelexION hält dabei die sogenannte "Separation Voltage" konstant hoch, und es wird nur die sogenannte "Compensation Voltage" automatisch gerampt (die Spannung wird automatisch hochgefahren und jeweils der Ziel-MRM-Übergang gesucht). Anhand der Aufzeichnung des gewünschten MRM erkennt das System die optimalen Spannungen und fügt diese automatisch den anderen MS-Tuningparametern hinzu.

Ein zusätzlicher Trennparameter kann durch das Einspeisen von bestimmten Lösungsmitteln wie z.B. Iso-Propanol in die Stickstoffumgebung (Dosierung in das Curtain-Gas; siehe Bild 6) eingeführt werden, um die Selektivität weiter zu steigern.

Die Art der Lösungsmittelmoleküle wird so ausgewählt, dass sie im Ionenmobilitätsfeld mit den Ionen beim Clustern und Declustern in Wechselwirkung kommen und ihren Compensation Voltage-Beitrag (CV) verändern. Man kann damit versuchen, Substanzen, die sich bei einer bestimmten CV-Spannung noch nicht genügend unterscheiden, besser zu separieren.

Polare Lösungsmittelmoleküle bilden speziell im schwachen elektrischen Feld zunehmend Ionen-Molekül-Cluster und vergrößern dadurch den Kollisionsquerschnitt, der wiederum dessen Mobilität reduziert. Beim Wechsel zum starken Feld erfolgt hingegen durch Dissoziation eine Verkleinerung des Clusters und damit Erhöhung der Mobilität. Die hochfrequente Wechselspannung sorgt trotz kurzer Driftstrecke für eine hohe Wiederholrate dieser Wechselwirkung.

Für den Analytiker ergibt sich im Idealfall eine zusätzliche Möglichkeit zur Erhöhung der  Selektivität, ohne die Ausgangs-Chromatographiebedingungen ändern zu müssen. Das Ziel ist eine Quantifizierung mit weniger Störsignalen und damit auch eine höhere Zuverlässigkeit der Gesamtmethode.

H-SRM
Eine weitere Möglichkeit, die Selektivität zu erhöhen, ist die Reduktion der sog. Halbwertsbreite der Massenpeaks von den für Quadrupole üblichen 0,5 ... 0,7 auf bis zu 0,2 Dalton. Die absolute Signalintensität wird dabei zwar auch geringer, wenn der chemische Untergrund jedoch überproportional unterdrückt werden kann, resultiert daraus die angestrebte Verbesserung von S/N. Die als "H-SRM" ("Highly Selective Reaction Monitoring") bezeichnete Technik wird von Thermo Fisher Scientific propagiert und erfordert besonders präzise hyperbolisch geschliffene Quadrupol-Stäbe im Q1. Nur die besten "Hyper-Quads" aus der Serienproduktion werden dafür eingesetzt. Als Auswahlkriterium gilt die Höhe der Transmissionsrate bei hoher Auflösung.

Scan-Wave
Waters produziert im klassischen Triple-Quadrupole-Segment neu konzipierte Hardware mit speziellen beziehungsweise erweiterten Funktionen. So ist beim Triple-Quadrupole-MS "Xevo TQ (-S) MS" z.B. die Stoßzelle mit der sog. "Travelling-Wave"- und "Scan-Wave"-Technologie ausgestattet, dessen Segmente die Ionen kontrollieren können (Bild 7).

Während mit den konventionellen Waters Triple-Quadrupol-Massenspektrometern (TQD und Quattro Premier XE) bereits seit einigen Jahren die Travelling-Wave-Technologie Anwendung findet, um die Kompatibilität zu den schnelleren Chromatographie-Einlass-Systemen (UPLC) zu gewährleisten, bietet der Xevo darüber hinaus die erweiterten Scan-Wave-Messfunktionen. Durch variable Ansteuerung der 122 Segmente können für die Ionen Barrieren in Form von elektrischen Wellen erzeugt werden (Bild 8), die sie in der Kollisionszelle sammeln und abhängig von der Masse wieder weiterleiten. Durch Synchronisation der Freigabe dieser Ionen mit dem Scan-Vorgang in Q3 kann die Empfindlichkeit im Produkt Ion Scan verbessert werden (Bild 9).

Daraus resultieren Spezialfunktionen wie z.B. "Dual Scan MRM" (DS-MRM), "Product Ion Confirmation Spectra" (PICS) und "Enhance Product Ion Chromatogramm" (PIC), welche der Identifizierung und Verifizierung zu Gute kommen können. Bei allen Scan-Modi ist dabei die Stoßzelle des Xevo TQ mit Argon angereichert, so dass sehr schnelle Umschaltzeiten zwischen den Scanvorgängen ermöglicht sind, wodurch wiederum die Kompatibilität zur schnellen Chromatographie besteht. Die neue Stoßzelle ist in der Lage, im Scan-Wave-Mode simultan MS Full Scan (Q3) und MS/MS-(MRM)-Daten zu akquirieren. Die Umschaltzeit beträgt nur maximal 5 ms, so dass auch auf schmalen UPLC-Peaks genügend Datenpunkte gesammelt werden können sollen.
In Bild 9 ist der Ablauf der Travelling-Wave im Scan-Wave-Modus in vier graphisch dargestellte Phasen gegliedert:

  • Akkumulation: Sammlung der Ionen in der Storage Region der Stoszelle vor einer DC-Barriere.
  • Transfer: Nach der Akkumulation werden die Ionen in die Scan-Wave-Region geschoben, wobei sie eine RF-Barriere stoppt.
  • Auslesen nach Masse/Ladungsverhältnis m/z: Eine DC-Barriere ermöglicht simultan die erneute Akkumulation, während durch stufenweise Absenkung der RF-Barriere die Ionen nach dem Masse/Ladungsverhältnis ausgescannt werden. Dabei werden Ionen mit großen m/z-Verhältnissen (blau) zuerst, dann mit mittleren m/z (rot) und letztlich mit kleinen m/z (grün) ausgelesen.

Dual-Scan-MRM gibt detaillierte Hinweise auf reale und potentielle Matrixstörungen und Matrixeffekte oder Ionenunterdrückung (Ion Suppression).

Die Scan-Wave-Funktion ermöglicht zusätzlich (aber auch parallel zum Dual-Scan-MRM) die Aufnahme sog. Product Ion Confirmation Spectras (PICS). Neben dem klassischen MRM-Peak eines oder vieler Zielanalyten erhält man darüber hinaus auch das zugehörige Massenspektrum entweder im Full-Scan- bzw. im Produkt-Ionen-Spektrum. Dabei wird automatisch ein kurzer Scanbereich (z.B.: 1 Scan) in der absteigenden Flanke des MRM-Peaks für diesen Scanmodus ausgewählt, um z.B. selektive Aussagen über die Qualität der Quantifizierung der Zielanalyten zu erhalten (unzureichende Trennung der Targetpeaks, Überlappung von Analyten, Retentionszeitenverschiebung und daraus resultierende Zuordnungsschwierigkeiten). Durch die Akkumulation (Bild 9) der Fragmentionen in der Stoßzelle können intensivere Produkt-Ionen-Spektren erhalten werden, die auch den Aufbau von spezifischen Spektrenbibliotheken ermöglichen.

QTRAP-Sonderfunktionen
Schon längere Zeit nutzt AB SCIEX die Möglichkeiten der als QTRAP bezeichneten linearen Ionenfalle (LIT) für Sonderfunktionen wie "Information Dependent Acquisition" (IDA) und "Enhanced Product Ion" (EPI), die ebenfalls der teils automatisierten Absicherung und Identifizierung dienen. Durch die schnellere Elektronik und die neue "Linear Accelerator Trap" mit Scan-Geschwindigkeiten bis 20 000 Da/s sind die Voraussetzungen dafür bei der neuesten Gerätegeneration (QTRAP 5500 bzw. 5600) noch besser.

Das QTRAP-Gerät ist wie ein konventionelles Triple-Quadrupol-Massenspektrometer aufgebaut. Allerdings kann der letzte Quadrupol Q3 auch als lineare Ionenfalle (LIT) mit dynamischer Füllzeit betrieben werden. D.h. es besteht bei diesem System die Möglichkeit, dass während der Füllung der LIT der "Ausgang" verschlossen ("Trapping") und nur beim "Scanning" geöffnet wird (Bild 10). Damit lassen sich höhere Empfindlichkeiten bei der Aufnahme von Produkt-Ionen-Spektren (EPI) erzielen.

Speziell für Multi Target Screenings kann der sehr rasch vollzogene Wechsel zwischen Multiple Reaction Monitoring (MRM) und EPI-Scan genutzt werden. Getriggert wird dieses Umschalten durch die Softwarefunktion "Information Dependent Acquisition". Ein IDA-Experiment vollzieht sich in den zwei Schritten Survey Scan und Dependent Scan. Tritt ein im Survey Scan programmiertes Ereignis (z.B. ein bestimmter Ionenübergang in einem MRM-Experiment) über einem Benutzerdefinierten Schwellenwert (Threshold) ein, so schaltet IDA das MS in den EPI-Scanmodus (Dependent Scan) um. Anschließend werden wieder MRMs aufgezeichnet. Darüber hinaus bietet die Software-Funktion "Dynamic Exclusion" die Möglichkeit, bestimmte Ionen oder Ionenübergänge automatisch für eine bestimmte Zeit oder auch generell auszuschließen. Das kann sinnvoll sein, um Zielanalyten mit einer schwachen Intensität neben coeluierenden, starken Störsignalen detektieren zu können (Bild 11).

Eine abgeänderte Form der o.g. automatischen Entscheidungsfindung realisiert z.B. Agilent mit einem klassischen Triple Quad. Die als "Triggered MRM"(tMRM) bezeichnete Software-Funktion erstellt allerdings bei Überschreiten eines definierten Target-MRM-Schwellenwertes keine kompletten Spektren, sondern eine Reihe von vorspezifizierten zusätzlichen Qualifiern (max. neun). Die Identifizierung der Zielsubstanz wird durch eine bestimmte Anzahl dieser getriggerten Zusatz-MRMs bestätigt. Das Konzept beruht auf der Überlegung, dass eine Qualifier-MRM nur dann gemessen werden soll, wenn das Targetsignal das Entscheidungslimit überschreitet. Damit soll durch Reduktion nicht unbedingt notwendiger, simultan gemessener MRMs Sensitivität gewonnen werden.

AB SCIEX nennt die gleiche Funktion "MRM-Triggered MRM". Um bei komplexen Matrices die übereilte Auslösung von IDA-Experimenten zu vermeiden, bietet AB SCIEX die Variante an, dass mehrere MRMs den Schwellenwert überschreiten müssen, um ein komplettes MS/MS-Spektrum zu messen ("Group MRM-Triggered MRM"). Schließlich lassen sich beide Funktionen kombinieren, so dass ein MRM die MRMGruppe auslöst und diese erst die Information Dependent Acquisition mit komplettem Spektrum aktiviert.

Bei den neuesten QTRAP-Geräten (6500) lassen sich z.B. bei der Methodenentwicklung die zu erwartenden Matrix-Effekt abschätzen, indem man zu den MRM-Spuren einen Enhanced MS-Scan mitaufzeichnen lässt, der nützliche Hinweise auf die Matrix-Komponenten gibt. Ein ähnliches Verfahren bietet Waters mit dem RADAR-Modus an.

Autor:
Wolfgang Brodacz
AGES
Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit, Lebensmittelsicherheit - Kontaminantenanalytik, Linz,
wolfgang.brodacz@ages.at

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