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Differenzierung und Expansion pluripotenter Stammzellen im geschlossenen System

Zellen mit ZukunftspotenzialDifferenzierung und Expansion pluripotenter Stammzellen im geschlossenen System

Pluripotente Stammzellen (PSC) und daraus differenzierte Vorläuferzellen sind die großen Hoffnungsträger in der regenerativen Medizin. Zahlreiche Erkrankungen, wie zum Beispiel Typ-1-Diabetes, altersabhängige Makuladystrophie und auch die Parkinson-Krankheit könnten in Zukunft mit Hilfe dieser Zellen behandelt werden.

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Zellen mit Zukunftspotenzial: Differenzierung und Expansion pluripotenter Stammzellen im geschlossenen System

Die Parkinson-Krankheit ist geprägt durch eine Degeneration dopaminerger Neuronen in der Substantia nigra, einem Teil des Mittelhirns. Vorklinische und klinische Studien zeigten, dass die Transplantation von fetalem mesenzephalem Gewebe die dopaminerge Aktivität wiederherstellen und Symptome der Parkinson-Krankheit lindern kann [1]. Anhand von Tiermodellen konnte in neueren Studien gezeigt werden, dass dopaminerge Vorläuferzellen, die aus humanen PSC differenziert worden waren, eine gute Alternative für die Transplantation darstellen könnten. Diese Zellen zeigten nämlich ähnliche Eigenschaften wie das fetale Gewebe im Hinblick auf die Fähigkeit zur terminalen Zelldifferenzierung, zur Integration und Projektion, zur regulierten Dopaminausschüttung und schließlich zur Besserung der Symptome [2-6]. Die aus PSC gewonnenen mesenzephalen dopaminergen (mesDA) Vorläuferzellen könnten somit eine Grundlage für die Entwicklung von Zelltherapien zur Bekämpfung der Parkinson-Krankheit darstellen. 

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Die mesDA Vorläuferzellen fallen unter sogenannte „Arzneimittel für neuartige Therapien“ (engl.: Advanced therapy medicinal products, ATMP). Diese unterliegen strikten regulatorischen Anforderungen. Standardisierte Reagenzien und in höchstem Maße reproduzierbare Produktionsabläufe sind dabei unerlässlich.

Zellen mit Zukunftspotenzial: Differenzierung und Expansion pluripotenter Stammzellen im geschlossenen System

Eine Automatisierung der PSC-Expansion und -Differenzierung könnte daher einen großen Beitrag zur Entwicklung erfolgreicher und kosteneffizienter Zelltherapien leisten. Basierend auf Miltenyi Biotecs CliniMACS Prodigy®[7], hatte die Firma Miltenyi Biotec bereits einen komplett automatisierten Arbeitsablauf zur Kultivierung und Expansion von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) entwickelt. Darauf aufbauend wurde nun ein Protokoll zur automatisierten Differenzierung von PSC in mesDA-Vorläuferzellen erarbeitet. Zusätzlich wurde ein Marker-Panel für die durchflusszytometrische Charakterisierung, d.h. Qualitätskontrolle (QC) der entstehenden mesDA-Vorläuferzellen, ausgearbeitet.

Automatisierte Herstellung von mesDA-Vorläuferzellen
Der CliniMACS Prodigy (Bild 1) ermöglicht die Automatisierung zahlreicher Zellherstellungsprozesse unter GMP-Bedingungen. Verschiedenartige Schlauchsets sind auf die jeweiligen Anforderungen ausgerichtet. Für die PSC-Kultivierung und -Differenzierung wurde das Schlauchset CliniMACS Prodigy TS 730 verwendet, an das bis zu acht Puffer-, Kulturmedien- und Reagenzienbehälter angeschlossen werden können. Zudem können Flüssigkeiten beim Transfer von einer externen 4 °C-Kühlanlage in die Kultivierungs- und Zentrifugationseinheit (CCU), einem integralen Bestandteil des Schlauchsets, vorgewärmt werden. Der Anschluss der Behälter an das Schlauchset erfolgt durch sterile Verschweißung. Schlauchset und Behälter stellen daraufhin ein funktional geschlossenes System dar. 

Zunächst werden PSC im CliniMACS Prodigy fünf Tage lang expandiert (Bild 2). Danach werden die Zellen in einem Gewebekulturgefäß differenziert, das sich in einem externen Inkubator außerhalb des CliniMACS Prodigy befindet, jedoch steril mit dem Schlauchset verbunden ist. Das ursprüngliche Differenzierungsprotokoll beruhte auf Embryonic Bodies und erlaubte eine reproduzierbare Herstellung von Vorläuferzellen im kleinen Labormaßstab [4]. Um jedoch PSC im größeren Maßstab automatisch und innerhalb des geschlossenen Systems des CliniMACS Prodigy differenzieren zu können, wurde das Protokoll zur vollständig adhärenten Kultivierung der Zellen weiterentwickelt [8, 9]. Die rostro-kaudale bzw. dorso-ventrale Musterbildung wurde durch steigende CHIR99201- bzw. SHH-Konzentrationen induziert (Bild 2).

Zellen mit Zukunftspotenzial: Differenzierung und Expansion pluripotenter Stammzellen im geschlossenen System

Alle Liquid-Handling-Schritte, einschließlich Waschen der CCU, Beschichten mit einem Matrixprotein, Entfernen des Matrixproteins, Ausbringen der Zellen, Medienwechsel und Ernten der Zellen, können vollautomatisch durchgeführt werden, mit Ausnahme möglicher Handhabung der externen Kulturgefäße.

Qualitätskontrolle mit Hilfe der Durchflusszytometrie
Um die differenzierten mesDA-Vorläuferzellen umfassend charakterisieren zu können, wurde ein Marker-Panel erstellt, welches es ermöglicht, die korrekte Identität, die Reinheit und eine potenzielle Tumorigenität dieser Zellen festzustellen. Bild 3a (siehe nächste Seite) zeigt die positiven (rot) bzw. negativen (blau) Marker, die für Zellen der jeweiligen Gehirnregionen charakteristisch sind.

Die positiven Marker IAP (integrin-associated protein, CD47)[10], FoxA2, OTX2 und Nkx2.1 wurden verwendet, um Zellen mit Charakteristika der ventralen Mittelhirnregion der Basalplatte zu identifizieren (B in Bild 3). Pax 6 hingegen deutet einen unerwünschten dorsalen oder rostralen Phänotyp an und ist in primitiven neuroektodermalen Zellen exprimiert (A in Bild 3). Nkx6.1-Expression und der Verlust der OTX2-Expression gehen mit dem kaudalen Phänotyp einher (D in Bild 3). Sox1 kennzeichnet den dorsalen Phänotyp und primitives Neuroektoderm (A, C und D in Bild 3). Ki-67 wurde verwendet, um die Proliferationsfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Oct3/4 diente zur Identifizierung verbleibender pluripotenter Zellen, deren Anwesenheit es auszuschließen gilt, da diese möglicherweise zur Tumorbildung (Teratom) führen könnten (B in Bild 3).

Zellen mit Zukunftspotenzial: Differenzierung und Expansion pluripotenter Stammzellen im geschlossenen System

Automatisierte vs. manuelle mesDA-Differenzierung
Das momentane Standardprotokoll zur Differenzierung von PSC in mesDA-Vorläuferzellen beruht auf zahlreichen manuellen Pipettier- und Waschvorgängen in Zellkulturplatten, z.B. 12-Well-Platten. Zur Überprüfung der Übertragbarkeit der Prozedur in das funktional geschlossene System wurden Zellen verglichen, die parallel mit dem manuellen Verfahren oder mit Hilfe des ClinMACS Prodigy differenziert wurden. Beide Herstellungsprozesse lieferten den gleichen mesDA-Phänotyp: Mehr als 90 % der Zellen waren positiv für OTX2, IAP und FoxA2 und negativ für PAX-6, Sox1 und Oct3/4 (Bild 4). Zudem zeigten die mesDA-Vorläuferzellen aus beiden Differenzierungsprotokollen eine geringere Proliferationsfähigkeit als die ursprünglichen pluripotenten Zellen.

Fazit
Die neu entwickelte Methode der adhärenten Kultivierung von humanen PSC und deren Differenzierung in mesDA-Vorläuferzellen kann vollautomatisch im geschlossenen System des CliniMACS Prodigy durchgeführt werden. Ein eigens dafür erstelltes Marker-Panel ermöglicht die umfassende Charakterisierung der mesDA-Vorläuferzellen mit Hilfe der Durchflusszytometrie.

Förderung:
Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem 7. Forschungsrahmenprogramm der Europäischen Union im Rahmen des NeuroStemcellRepair-Projekts gefördert.

Literatur
[1] Barker, R. A. et al. (2015) Cell-based therapies for Parkinson disease - past insights and future potential. Nat. Rev. Neurol. 11: 492-503.
[2] Doi, D. et al. (2014) Isolation of human induced pluripotent stem cell-derived dopaminergic progenitors by cell sorting for successful transplantation. Stem Cell Reports 2: 337-350.
[3] Grealish, S. et al. (2014) Human ESCderived dopamine neurons show similar preclinical efficacy and potency to fetal neurons when grafted in a rat model of Parkinson‘s disease. Cell Stem Cell 15: 653-665.
[4] Kirkeby, A. et al. (2012) Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1: 703-714.
[5] Kriks, S. et al. (2011) Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson‘s disease. Nature 480: 547-551.
[6] Steinbeck, J. A. et al. (2015) Optogenetics enables functional analysis of human embryonic stem cell-derived grafts in a
Parkinson‘s disease model. Nat. Biotechnol. 33: 204-209.
[7] Apel, M. et al. (2013) Integrated clinical scale manufacturing system for cellular products derived by magnetic cell separation, centrifugation and cell culture. Chemie Ingenieur Technik 85: 103–110.
[8] Kirkeby, A. et al. (2017) Predictive markers guide differentiation to improve graft outcome in clinical translation of hESC-based therapy for Parkinson‘s disease. Cell Stem Cell 20: 135-148.
[9] Nolbrant, S. et al. (2017) Generation of high-purity human ventral midbrain dopaminergic progenitors for in vitro maturation and intracerebral transplantation. Nat. Protoc. 12: 1962-1979.
[10] Lehnen, D. et al. (2017) IAP-based cell sorting results in homogeneous transplantable dopaminergic precursor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports 9: 1207-1220.

Frank Jüngerkes, Tristan Kuchler, Melanie Jungblut, Andreas Bosio, Sebastian Knöbel

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