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Harmonisierte EU-Richtlinie für LOD und LOQ - Grenzen der Kontaminantenanalytik

Histologie in 3DNeue Färbemethode ermöglicht Nano-CT-Aufnahmen von Gewebeproben

Prof. Franz Pfeiffer montiert eine Probe am Nano-CT-Gerät

Bislang werden Gewebeproben von Patienten für histologische Untersuchungen in dünne Scheiben geschnitten. Das könnte sich in Zukunft ändern: Ein interdisziplinäres Team TUM hat eine Färbemethode entwickelt, die es erlaubt, dreidimensionale Gewebeproben mit dem ebenfalls kürzlich an der TUM entwickelten Nano-CT-Gerät zu untersuchen.

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Harmonisierte EU-Richtlinie für LOD und LOQGrenzen der Kontaminantenanalytik

Die Erfassungsgrenze LOD und Bestimmungsgrenze LOQ gehören zu den wichtigsten Kenndaten zur Charakterisierung der Leistungsfähigkeit einer Analysenmethode bei niedrigen Konzentrationen. Zu ihrer Ermittlung sind eine Reihe unterschiedlicher Verfahren gebräuchlich, die auch zu entsprechend differierenden Ergebnissen führen können.

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Harmonisierte EU-Richtlinie für LOD und LOQ: Grenzen der Kontaminantenanalytik

In einem gemeinsamen „Guidance Document“ geben nun mehrere EU-Referenzlabors wertvolle Hilfestellung bei der Auswahl geeigneter Verfahren und treiben mit Empfehlungen für die Kontaminanten-Analytik eine wünschenswerte Harmonisierung voran.

Gleich vorweg ein Hinweis auf die Konfusion zwischen deutschen und englischen Begriffen: Im deutschen Sprachgebrauch wird „Limit of Detection“ LOD sehr oft als Nachweisgrenze angesehen, was aber nicht ganz korrekt ist, da beide Begriffe auf unterschiedlichen statistischen Annahmen beruhen. Dem deutschen Ausdruck „Nachweisgrenze“ entspricht vielmehr der engl. Begriff „Critical Value“, während das deutsche Pendant für das englische LOD in diesem Kontext genau genommen die Erfassungsgrenze ist. Aus diesem Grund soll hier immer der international übliche Ausdruck „Limit of Detection“ LOD verwendet werden. Die Bestimmungsgrenze ist wie gewohnt das engl. „Limit of Quantitation“ LOQ.

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Abgesehen von der sprachlichen Verwirrung gibt es auch noch viele Ansätze zur Bestimmung von LOD und LOQ. Diese werden von den Labors in der Praxis in unterschiedlicher Weise angewendet. Dabei kommt es immer wieder zu teils erheblichen Differenzen zwischen den Angaben der verschiedenen Labors. Entsprechend fraglich ist auch die Vergleichbarkeit der ermittelten Kenndaten. Um eine Hilfestellung dafür zu geben und möglichst auch eine gemeinsame Richtung für eine Harmonisierung einzuschlagen, war es notwendig, dass die wichtigsten europäischen Referenzlaboratorien (EURL) auf dem Gebiet der Kontaminantenanalytik einen harmonisierten Vorschlag erarbeiten. Unter der Leitung von Thomas Wenzl (EU Reference Laboratory for Polycyclic Aromatic Hydrocarbons) waren an maßgeblicher Stelle Johannes Haedrich und Alexander Schaechtele (EU Reference Laboratory for Dioxins and PCBs in Feed and Food), Piotr Robouch (EU Reference Laboratory for Heavy Metals in Feed and Food) und Joerg Stroka (EU Reference Laboratory for Mycotoxins) beteiligt.

Bestimmung von „Limit of Detection“

Die vier EURLs haben sich gemeinsam auf das sog. „Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food“ [1] geeinigt, das die Vielfalt an Möglichkeiten, diese Kenndaten zu bestimmen, auf wenige Varianten vereinheitlichen soll. Die Vorgabe für die Richtlinie war, dass sie wissenschaftlich korrekt sein muss und gleichzeitig durch strikte Beschränkung auf den notwendigen Aufwand auch praktikabel in der Anwendung sein sollte.

Die EURLs für PAHs, Mykotoxine und Schwermetalle sind bei der Erstellung dieses Leitfadens übereingekommen, dass für diese Kontaminanten-Typen die statistische Abschätzung von LOD und LOQ auf der Basis von Blank-Materialien am zielführendsten ist. Das Verfahren sollte auch für andere rückstands-analytische Applikationen gut anwendbar sein. Für die Dioxinanalytik mittels GC-MS und isotopenmarkierter interner Standards hingegen wird vom zuständigen EURL das „Signal to Noise“-Verfahren präferiert (auf diese sehr spezielle Analytik kann hier aus Platzgründen nicht näher eingegangen werden).

Der hier zusammenfassend vorgestellte Leitfaden ist z.B. vorgesehen für Monitoring-Ergebnisse und für Werte zu Belastungsmodellen, bei denen auch niedrige Grundgehalte wichtig sein können. Für die Überwachung von Grenzwertüberschreitungen ist die exakte Kenntnis von LOD und LOQ meist nicht unbedingt erforderlich, es sei denn, die Bestimmungsgrenzen befinden sich in der Nähe der Grenzwerte.

Bestimmung von „Limit of Detection“

Gruppenbildung
Grundsätzlich sollten Nachweis- und Bestimmungsgrenze eines definierten Analyten für jede einzelne Matrix erfasst werden. Multimethoden werden aufgrund ihrer Schnelligkeit und wegen des ökonomischen Vorteils immer populärer, ebenso wie eine möglichst breite Matrix-Spreizung. Multianalyt- und Multimatrix-Methoden erfordern aus Gründen der Praktikabilität daher eine zusammenfassende Vereinfachung, die sich in den meisten Fällen in einer Gruppierung von ähnlichen Matrixtypen ausdrückt.

Für den Lebensmittelbereich kann man sich beispielhaft an der „Verordnung (EU) Nr. 519/2014 der Kommission“ (vom 16. Mai 2014 zur Änderung der Verordnung (EG) Nr. 401/2006) orientieren. Sie fasst für die Validierung von Mykotoxin-Screeningmethoden diverse Warenkategorien mit typischen repräsentativen Produkten zu übersichtlichen Warengruppen zusammen und regelt Folgendes: Eine Erstvalidierung sollte für jede Ware oder – wenn die Methode bekanntermaßen für mehrere Waren anwendbar ist – für jede Warengruppe erfolgen. In letzterem Fall ist eine repräsentative und relevante Ware aus der Gruppe auszuwählen. Kann die Methode bekanntermaßen oder aller Voraussicht nach bei anderen Waren angewandt werden, so ist die Gültigkeit für diese anderen Waren zu überprüfen. Gehört die neue Ware einer Warengruppe an, für die bereits eine Erstvalidierung durchgeführt wurde, so ist eine eingeschränkte Zusatzvalidierung ausreichend.

Die Gruppierung wird hier folgendermaßen wiedergegeben: Warengruppen an erster Stelle, nachfolgend (nach Doppelpunkt) die Warenkategorien (mit typischen repräsentativen Waren für die jeweilige Kategorie).

  • Hoher Wassergehalt: Fruchtsäfte (Apfelsaft, Traubensaft), Alkoholische Getränke (Wein, Bier, Obstwein), Wurzel- und Knollengemüse (Frischer Ingwer), Pürees auf Getreide- oder Obstbasis (Breie für Säuglinge und Kleinkinder).
  • Hoher Ölgehalt: Schalenfrüchte (Walnüsse, Haselnüsse, Esskastanien), Ölsaaten und Erzeugnisse daraus (Ölraps, Sonnenblumen, Baumwollsaat, Sojabohnen, Erdnüsse, Sesam, usw.), Ölfrüchte und Erzeugnisse daraus (Öle und Pasten wie Erdnussbutter, Tahina).
  • Hoher Stärke- und/oder Eiweißgehalt und geringer Wasser- und Fettgehalt: Getreidekorn und Erzeugnisse daraus (Weizen, Roggen, Gerste, Mais, Reis, Hafervollkornbrot, Weißbrot, Cracker, Frühstückszerealien, Teigwaren), Diätetische Erzeugnisse (Trockenpulver für die Zubereitung von Nahrung für Säuglinge und Kleinkinder).
  • Hoher Säuregehalt und hoher Wassergehalt: Zitrusfrüchteerzeugnisse (wird zur Stabilisierung der pH-Änderungen bei der Extraktion ein Puffer verwendet, so kann diese Warengruppe zu einer Warengruppe ‚Hoher Wassergehalt‘ zusammengefasst werden).
  • Hoher Zuckergehalt und geringer Wassergehalt: Trockenfrüchte (Feigen, Rosinen, Korinthen, Sultaninen).
  • Milch und Milcherzeugnisse: Milch (Kuh-, Ziegen- und Büffelmilch), Käse (Kuh- und Ziegenkäse), Molkereiprodukte (z.B. Milchpulver, Joghurt, Rahm).
  • ‚Schwierige oder einzigartige Waren‘ (Kakaobohnen und Erzeugnisse daraus, Kopra und Erzeugnisse daraus, Kaffee, Tee, Gewürze, Süßholz, etc; diese müssen nur dann vollständig validiert werden, wenn sie häufig analysiert werden).
Bestimmung von „Limit of Detection“

Speziell für die Pestizid-Analytik existiert im EU-Guidance Document SANTE/11945/2015 („Method Validation & Quality Control Procedures for Pes-ticide Residues Analysis in Food & Feed“) im Annex A (Commodity groups and representative commodities) ebenfalls eine sehr gut strukturierte Einteilung zur Gruppenbildung von Matrizes.

Unter bestimmten Um- ständen ist auch eine noch weitergehende Vereinfachung zulässig. Wenn nämlich bewiesen ist, dass das gesamte analytische Verfahren keinen signifikanten Einfluss auf die Variabilität und Steigung der Kalibrierfunktion hat, können auch die sog. Instrumenten-LOD (iLOD) und Instrumenten-LOQ (iLOQ) unter Berücksichtigung von Aliquotierungsfaktoren (Multipier etc.) herangezogen werden. Diese Instrumenten-Kenndaten stammen aus Wiederholmessungen von reinen Kalibrierstandards in Lösungsmittel und sind mit deutlich weniger Laboraufwand bestimmbar. Dabei müssen selbstverständlich immer alle Identifizierungskriterien wie die Retentionszeiten und in der Massenspektrometrie die Ionenverhältnisse zwischen Target und Qualifier zur Gänze erfüllt sein.

Grenzen ziehen
Unter Limit of Detection LOD versteht man jene Konzentration, von der man annehmen kann, dass das Messverfahren sie mit üblicherweise 95%iger Wahrscheinlichkeit detektieren wird und an der man nur mit 5 % falsch-positiven Ergebnissen rechnen muss.

Berechnungs-Tool zur automatischen Ermittlung von LOD

Die Berechnungen beruhen auf der statistischen Betrachtung der Variabilität von Wiederholmessungen einer repräsentativen sog. Blank-Probe (im Weiteren der Einfachheit halber nur als Blank bezeichnet). Dieses auch als Leermatrix bezeichnete Material ist dadurch charakterisiert, dass praktisch keine Zielanalyten nachweisbar sind. Dieses strenge Kriterium kann in der Kontaminantenanalytik allerdings nicht immer erfüllt werden, da viele Schadstoffe gerade in den interessierenden niederen Konzentrationsbereichen ubiquitär vorhanden sind. Daher ist es für die praktische Durchführung dieser Verfahren wichtig, auch sogenannte Pseudo-Blanks zu akzeptieren. Pseudo-Blanks zeichnen sich dadurch aus, dass sie nur sehr gering kontaminiert sind, und idealerweise keine höheren Belastungen aufweisen, als dem zu erwartenden Limit of Detection entspricht (≤1 x LOD). Als oberste Konzentration wird für Pseudo-Blanks das Fünffache der voraussichtlichen LOD (≤5 x LOD) angesehen.

In diesem Zusammenhang darf auch angemerkt werden, dass für die notwendigen Wiederholmessungen nicht immer nur dasselbe Blank-Material verwendet werden muss, sondern, dass es sogar von Vorteil ist, mehrere ähnliche Matrizes an der Überprüfung der Variabilität zu beteiligen. Die individuell aufgearbeiteten Extrakte dieser verschiedenen Blanks sollen daher auch nicht „gepoolt“ werden, damit die Einflüsse von eventuellen Unterschieden bei Extraktion, Clean up und Messung nicht verloren gehen. Eine solche Durchschnittsbildung könnte sonst zu einer Unterschätzung von LOD und LOQ führen.

Als statistische Voraussetzungen muss die sog. Varianzhomogenität gegeben sein und die Wiederholmessungen müssen unabhängig voneinander sein. Die Homogenität der Varianzen ist kaum jemals über mehr als eine Zehnerpotenz gegeben, daher dürfen nur Daten aus diesem unteren Bereich der Kalibrierfunktion herangezogen werden. Ansonsten würden unrealistisch hohe Grenzen resultieren. Zudem ist es erforderlich, dass der Detektorresponse in diesem Bereich und bis nahe an die Bestimmungsgrenze ausreichend gute Linearität aufweist.

Blanks und Pseudo-Blanks
Wie schon angeführt, wird für die Kontaminantenanalytik (Ausnahme: Dioxine) die Bestimmung von Limit of Detection über die Variabilität von Wiederholanalysen eines Blanks präferiert. Die Anzahl der parallelen Messungen richtet sich dabei nach dem Zweck des Analysenverfahrens. Ist es auf den Nachweis von z.B. verbotenen Substanzen ausgerichtet, bei denen schon der Nachweis, d.h. die Überschreitung von LOD, zu rechtlichen Folgen führt, sind üblicherweise 20 Wiederholanalysen erforderlich. In den meisten Fällen der Kontaminantenanalytik bestehen jedoch keine sog. Nulltoleranz-Anforderungen und sowohl das Limit of Detection als auch die Bestimmungsgrenze liegen üblicherweise ausreichend weit unter den Grenzwerten. In dieser überwiegenden Anzahl von Fällen genügen zumindest zehn Messungen der Blanks unter Wiederholbedingungen.

Diese zehn Aufarbeitungen mit den anschließenden Messungen müssen unabhängig voneinander durchgeführt werden und die resultierende Variabilität geht letztlich in Form der Standardabweichung in die Berechnung von LOD ein (siehe angeführte Formel in Bild 1, unten). Die Steigung b der Kalibrierkurve bezieht sich auf einen Konzentrationsbereich, dessen höchster Level maximal das Zehnfache der erwarteten LOD sein darf.

Paired Observations
Die ubiquitäre Verbreitung bestimmter Kontaminanten ist oftmals der Grund, dass die Blank-Methode nicht angewendet werden kann. Für diese relativ häufigen Fälle wurde die sog. „Paired Observations“-Variante im Sinne von gekoppelten bzw. paarweisen Beobachtungen entwickelt.

Der Ansatz beruht darauf, dass einerseits eine Reihe von Blanks für sich allein gemessen und parallel dazu jeweils ein Aliquot der Blanks nach zusätzlicher Dotierung vermessen werden. Bei der definierten Zugabe einer geringen Analytmenge (auch als Spiken bezeichnet) ist darauf zu achten, dass alle Blanks mit der gleichen, konstanten Masse an Zielanalyten aufgestockt werden.

Die Differenz der quasi gekoppelten Signale zwischen einem dotierten Blank und dem korrespondierenden reinen Blank geht dann als Messwert für eine einzelne Dotierung in die Statistik ein.

Paired Observations bedeutet zwar doppelten Aufwand, die Methode hat aber gerade bei einem großen Spektrum an erwünschten Matrixvarianten praktische Vorteile. Wo sonst für jede Matrixart eigene unabhängige Ermittlungen der LODs mit jeweils zehn Messungen desselben Materials stattfinden müssten, relativiert sich dieses Gegenargument sehr schnell. Bei der Paired Observations-Methode dürfen nämlich auch unterschiedliche Probenmatrizes, unter der Voraussetzung relativ gleichen analytischen Verhaltens, gemeinsam eingesetzt werden, woraus sich die Gültigkeit von LOD und folglich auch die Bestimmungsgrenzen für einen wesentlich breiteren Anwendungsbereich ableiten lassen.

Für den praktischen Ablauf werden zuerst zehn Pseudo-Blanks ausgewählt, die von unterschiedlichen Matrizes stammen dürfen, ja bei Multimatrix-Methoden sogar sollen. Die unvermeidlich vorhandenen Analytkonzentrationen sollten möglichst klein sein. Vor allen Dingen sollten sie innerhalb der unterschiedlichen Matrizes vergleichbar klein sein, da sie alle mit derselben Menge dotiert (d.h. aufgestockt) werden.

Im zweiten Schritt werden zehn Aliquote der Pseudo-Blanks mit je einem geringen Spike-Level dotiert (Bild 2, oben). Die Höhe dieser Aufstockung muss für alle gleich sein und am besten dem zu erwarteten Limit of Detection entsprechen. Die Dotierung darf jedenfalls nicht höher sein als das Fünffache von der erwarteten LOD.

Nun erfolgen zwanzig komplette Analysen, d.h. Aufarbeitung und Messung der zehn nativen Pseudo-Blanks mit sehr niedriger Belastung und der zehn aufgestockten Pseudo-Blanks. Die Analysen müssen gemeinsam unter Vergleichsbedingungen durchgeführt werden.

Anschließend findet die Berechnung der Differenz-Signale statt, indem der Analysenwert der jeweiligen Pseudo-Blanks vom Analysenwert der korrespondierenden (gekoppelten) Spikes subtrahiert wird. Aus der Variabilität der Netto-Signale, d.h. der Differenzen, wird die Standardabweichung ermittelt, die wiederum gemeinsam mit der Steigung der Kalibrierfunktion die LOD-Berechnung bestimmen (siehe Formel in Bild 2, unten).

Der Paired Observations-Ansatz kann auch mit Messungen durchgeführt werden, die auf einer sog. „Background Subtraction“ beruhen, wie sie bei manchen massenspektrometrischen Auswertungen möglich und teilweise üblich sind.

Kalibriergerade
Dieser Ansatz beruht auf Kalibrierkurven, die von repräsentativen Blanks bzw. Pseudo-Blanks stammen, welche äquidistant (d.h. mit gleichem Konzentrationsabstand) dotiert werden.

Vier verschiedene Konzentrations-Levels mit einem Blank (ohne Dotierung), d.h. fünf Niveaus, werden je zweimal aufgearbeitet und gemessen. Mit den zehn Werten (entspricht fünf Doppelbestimmungen) wird eine Kalibrierkurve mit (ungewichteter) linearer Regression erstellt. Aus den resultierenden Kenndaten wird entsprechend der Gleichung in Bild 3, unten, das LOD berechnet.

Es ist darauf zu achten, dass der höchste Kalibrierpunkt maximal das Zehnfache des erwarteten Limit of Detection ausmachen darf. Sollte sich herausstellen, dass der höchste Punkt dieses Limit überschreitet, müssen weitere niedrigere Konzentrationen analysiert werden. Außerdem darf der Konzentrationsbereich nicht zu weit gewählt werden, weil sonst die Wahrscheinlichkeit für sog. Varianzinhomogenitäten steigt und daraus ein zu hoher Wert für LOD resultieren würde.

Auch bei diesem Verfahren ist eine Vereinfachung unter folgenden Bedingungen erlaubt: Wenn sichergestellt werden kann, dass die Analysen nicht durch Matrixeffekte und/oder Interferenzen beeinflusst werden, dürfen anstatt der Aufarbeitungen auch reine Kalibrierstandards in Lösungsmittel für die Erstellung der benötigten Kalibrierkurve verwendet werden.

Bestimmungsgrenze LOQ
Die EU-Regelung 333/2007 (EU 2007) sieht für die Beprobung und Analytik verschiedener Kontaminanten im Rahmen der offiziellen Kontrolle von Lebensmitteln folgende Definition vor:

LOD gilt als dreifache Standardabweichung von Blank-Bestimmungen und die Bestimmungsgrenze LOQ als das Sechs- oder Zehnfache der Standardabweichung. Das heißt, das Verhältnis zwischen LOD und LOQ entspricht damit 2 bzw. 3,3. Um eine Harmonisierung für die Bestimmungsgrenzen-Definition einzuleiten, spezifiziert das derzeitige Leitdokument die Zehnfach-Variante. Daraus ergibt sich als die Bestimmungsgrenze LOQ der 3,3-fache Wert der oben ermittelten LOD.

Automatisches Berechnungs-Tool
Sehr erfreulich ist, dass die EU unter dem Web-Link: http://eurlhm.eu/lod/index.html ein kostenloses Berechnungs-Tool mit der Bezeichnung „The toolbox“ zur Verfügung stellt. Die von Piotr Robouch erstellte Webpage kalkuliert die LOD/LOQ-Schätzwerte automatisch entsprechend dem oben genannten Guidance-Dokument.

Der Benutzer muss nur noch eine der vorgeschlagenen Berechnungsmethoden auswählen (siehe hierzu Bild 4) und die Rohdaten eingeben. Man kann auch den experimentellen Umfang erhöhen (beispielsweise zwanzig Wiederholproben anstatt zehn), ohne dass man sich über die Adaption der Formeln Gedanken machen muss.

Referenzen
[1] Thomas Wenzl, Johannes Haedrich, Alexander Schaechtele, Piotr Robouch, Joerg Stroka: Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food. 2016; https://ec.europa.eu/jrc/en/eurl/pahs
https://ec.europa.eu/jrc/sites/jrcsh/files/lod_loq_guidance_document_food_contaminants_2016.pdf
http://hdl.handle.net/2268/199914

Wolfgang Brodacz

Autor:
Wolfgang Brodacz
AGES Österreichische Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Lebensmittelsicherheit – Kontaminantenanalytik
A-4020 Linz
E-Mail: wolfgang.brodacz@ages.at

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