Tagungsbericht

HPLC 2019

Das „48th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques“, die HPLC 2019, fand im Juni in der Università di Milano-Bicocca, Mailand, statt. Stavros Kromidas war dabei und schildert seine Eindrücke vom wichtigsten Symposium auf dem Gebiet der HPLC und verwandter Techniken.

Die HPLC 2019, das „48th International Symposium on High-Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques“, fand vom 16. bis zum 20. Juni 2019 in Mailand statt. (Auf dem Bild ist der Mailänder Dom zu sehen.) © Shutterstock/Noppasin Wongchum

Um es gleich vorwegzunehmen: Mein Gesamteindruck der HPLC 2019 mit rund 1 300 Teilnehmern, 50 Ausstellern und 300 Vorträgen war sehr positiv – bezogen auf das Fachliche. Manches Orga­nisatorische (aus meiner Sicht weniger wichtig) war verbesserungswürdig.

Suboptimal: Räumlichkeiten, Technik, Service
Eine Uni ist eben doch kein professionelles Konferenzzentrum. So fand z. B. wegen fehlender Klimatisierung in vielen Räumen ein permanentes „Raum-Wechsel-Dich-Spiel“ statt. – Ein Strom-Blackout kann überall passieren. In Italien ist es ein Erlebnis: Aus „just two minutes“ wurden 22 Minuten – und wenn der Strom wiederkam, dann wellenartig oder nur teilweise: zuerst nur bis zum Lichtschalter, erst später bis zum Mikrofon. Bis zur Laptop-Beamer-Verbindung schaffte er es gar nicht mehr. War dies vielleicht doch der handfeste Beweis dafür, dass die Raum-Zeit-Krümmung südlich der Alpen schon ´mal im Alltag zu spüren ist? Wie auch immer: Die Retro-Lösung à la 70er/80er Jahre ( „Next slide please!“) hatte 'was…

Nicht schön war das gelangweilte, unflexible Servicepersonal. Es ist befremdlich, wenn bei einer derartigen Hitze und einem vollen Programm kurz vor der geplanten Kaffeepause das Ausschenken verweigert wird und jemand mit der Miene eines angestrengten Bankdirektors drei Mal, alle fünf Minuten, verkündet: „In fünf Minuten gibt es Kaffee – jetzt nicht!“ Die Besucher haben irgendwann richtig reagiert (…). Das sind Momente, in denen man verinnerlicht, wieso Anarchie in Italien eine große Tradition hat.

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Positiv: App, Zeitdisziplin, neue Formate
Eine App lieferte quasi in Real-Time aktuelle Infos zur Tagung, so z. B. zum erforderlichen Wechsel eines Vortragsraums. Die Vorträge waren kurz, meist 15 Minuten, und man hat peinlichst auf Einhaltung der Redezeit geachtet. Die Qualität der Vorträge war hervorragend.

Eine sehr gute Idee war die Einführung zweier neuer Formate, in denen junge WissenschaftlerInnen aus ihrer Forschung berichteten. Der „HPLC-Slam“ bestand aus einem zweiminütigen Vortrag und einem dreiminütigen Video. Beim Format „HPLC-Tube“ wurde sieben Minuten lang (kreativ) präsentiert, z. B. in Form eines Stummfilms, eines Rap-Videos oder einer Multi-Media-Powerpoint-Präsentation.

Drei Bemerkungen von meiner Seite zum Gesamteindruck dessen, was nicht das Inhaltliche der Veranstaltung betraf:

  • Die räumlichen Gegebenheiten waren so, dass man sich immer wieder begegnet ist. Und das war positiv. Um Alexandra Knauer zu zitieren, war dann die Örtlichkeit letztendlich doch „sympathisch“.
  • Die Dichte der Vorträge war enorm. Man fühlte sich wie ein Dauerläufer, wollte man nichts Wichtiges verpassen; nach einem Vortrag war kaum Zeit für Fragen. Es wäre wünschenswert, wenn in zwei Jahren bei der nächsten Tagung in Düsseldorf die Anzahl der Vorträge kleiner wäre – trotz verständlicher Zwänge, denen die zwei Chairmen abermals ausgesetzt sein werden…
  • Ich muss leider wieder das Gleiche berichten wie bereits vor Jahren: Von den 297 Vorträgen wurden nur elf von jungen Wissenschaftlern aus Unis und Forschungseinrichtungen aus Deutschland gehalten. Die restlichen, spärlichen Beiträge aus Deutschland stammten von Firmenvertretern und Professoren und/oder die Redner waren jenseits der 50.

Drei Megatrends waren zu erkennen
2D-Chromatographie: Mehrdimensionale Trennungen haben einen großen Raum eingenommen, sowohl was die Zahl der Vorträge betrifft, als auch die der Anwesenden. Die Vielfalt hat zugenommen; das betrifft die verwendeten Mechanismen in der 1. und 2. Dimension (z. B. HILIC x RP, HILIC x HILIC, RP x SFC usw.) sowie die Hardware-Vielfalt. Kurzfazit: RPLC x RPLC-MS scheint – auch durch die mittlerweile angebotenen Geräte und die umfangreiche Unterstützung seitens der Hersteller – eine gewisse Reife erlangt zu haben; die Akzeptanz nimmt zu. Hier tut sich definitiv etwas, natürlich zunächst im forschenden Umfeld. Bezüglich anderer Varianten von 2/3D-Techniken (s. u.): Hier wird es noch einige Zeit dauern, bis diese in Industrielabors auf breiter Basis zu sehen sein werden.

MS – die „Attraktive“…: Es ist nur eine Frage der Zeit, bis MS dem UV/DAD-Detektor die Erstplatzierung bei den HPLC-Detektoren streitig machen wird, zumal in der Zwischenzeit eine ganze Palette an MS-Detektoren angeboten wird. Von dem güns­tigen, einfachen, kompakten und robusten Single-Mode-MS-Detektor für die Routine bis hin zu HRMS (High Resolution MS) und IMS (Ion Mobility Spectroscopy). Wenn irgendwie möglich, wird heute versucht, jede Trenntechnik mit der MS zu koppeln. Nachfolgend eine Auswahl von Kopplungen, die nach meiner Ansicht bereits jetzt wichtig sind bzw. noch eine vielversprechende Zukunft vor sich haben. Hinter diesen (zugegebenermaßen ermüdend zu lesenden) Acronymen steckt ein enormes analytisches Potenzial:

  • SPE-CE-ESI-MS,
  • Chip-ESI-IMS,
  • Chip-LC-FLD-MS,
  • HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS,
  • 2D-LC-IMS/QTOF,
  • UHPGPC-MS,
  • HILIC x RPLC-HRMS,
  • IEC-UV x RPLC-MS.

UHPLC erobert die „Biowelt“: Wenn man berücksichtigt, dass 2017 sieben der „Top-10-­Medikamente“ Biopharmazeutika waren und die prognostizierten jährlichen Zuwachsraten bis 2024 bei ca. 20 % liegen, ist das Interesse für Biomoleküle mehr als verständlich. Die UHPLC-Technik erobert die „Biowelt“: Kleine Teilchen, kurze/dünne Säulen, z. B: statt 300 mm, 7,8 mm ID und 5 µm nun 150 mm, 4,6 mm ID und 1,7/2,5 µm, also UHPIEC­ bzw. UHPSEC (z. B.: TSKgel UP-SW3000, 2 µm von Tosoh Bioscience). Auch die Core-Shell-Technologie findet hier Einzug, z. B. Core-Shell-Teilchen mit 1 000 Å (s. u.).

Hardware-Highlights

  • VICI TrueNano UHPLC Gradient Pumping System: ca. 10 x 10 x 20 cm, Flussmin. 10 nl/min, Injektionsvolumen 5 nl, Druck 1 500 bar (www.vici.com).
  • Portables HPLC-Gerät, speziell für den Outdoor-Einsatz z. B. in abgelegenen Gegenden Afrikas entwickelt: 6,7 kg inkl. Eluent, batteriebetrieben (13 h), ohne Pumpenteil (vorkomprimiertes Gas), demnächst als Gradientensystem erhältlich. Um die Robustheit des Gerätes zu demonstrieren, wurde ein Video gezeigt, in dem der Koffer mit dem Gerät aus einer Höhe von über einem Meter fallengelassen wurde; anschließend erfolgte eine Aminosäurentrennung mit einem Vk von 0,2 % (King´s College London).
  • Solvere Carbon Selective Detector (CSD): FID-Detektor für die HPLC. Noch recht früh, um ein Urteil abzugeben. Sollte er tatsächlich funktionieren, würde er als Universaldetektor eine sehr interessante Erweiterung der Detektionsmöglichkeiten bedeuten (www.activatedresearch.com).
  • DiscoverIR-LC; FTIR-Detektor für die HPLC: Da das Lösungsmittel nach Durchlaufen der Säule entfernt wird, soll das Gerät für alle gängigen HPLC-Lösungsmittel und auch im Gradientenmodus geeignet sein. Empfindlichkeit: 1 µg pro Komponente. Auch für dieses Gerät gilt das weiter oben Gesagte: Sollte der Detektor sich im Alltag bewähren, wäre mit seiner Hilfe eine relativ substanzspezifische Detektion möglich (www.spectra-analysis.com).
  • Die knappe Zeit in den Labors beflügelt das Vorantreiben von parallelen Trennungen: Alle großen Hersteller bieten Systeme mit unabhängigen „Fluidic Paths“ an.
  • Ferner: MISER-Anwendungen (MISER: Multiple Injections in a Single Experimen     tal Run) für einfache Trennungen in der Routine (z. B. Qualitätskontrolle von Softdrinks) geraten immer mehr in den Fokus.
  • Vacuum-jacketed column (VJC); das Prinzip: Ein Metallmantel wird um die Säule angebracht, unter Vakuum (10-7 Torr) wirkt er wie eine thermische Barriere zwischen „innen“ und „außen“. Ergebnis ist ein quasi-adiabatisches System, was zu einem enormen Gewinn an Effizienz führt: Die Peakverbreiterung wird stark herabgesetzt. Das System wurde zwar von Fabrice Gritti (Waters) bereits im letzten Jahr beschrieben, die große Aufmerksamkeit hat es aber in Mailand erfahren.

Neues von der „HPLC-Front“

Miniaturisierung: Micro und Nano war ges­tern, die „Bühne“ wird von Chips dominiert. Die Chip-Technologie schreitet voran, man kann von einem erneuten Hype sprechen. Hier einige Beispiele:

  • Trennung von chiralen Substanzen auf einem Chip innerhalb 4 – 6 s;
  • duale Detektion, z. B. Chip-LC-FLD-MS;
  • “2DHPLC on a Chip”, z. B: 1. Dimension C18, 2. Dimension chirale stationäre Phase;
  • High-Temperature-Chip-HPLC; Temperaturgradient bis auf 170 °C, Trennzeit 20 s.

3D-Druck: Fittings und Säulen werden bereits gedruckt, die 3D-Technologie gewinnt im Bereich der HPLC-Accessoires an Boden.

Multidimensionale Chromatographie: Die Wichtigkeit des Themas wurde durch mehrere Sessions unterstrichen. Die Anwendungsfelder nehmen permanent zu, hier seien nur zwei genannt: NPLC x SEC und MTF x SEC (MTF: Molecular Topology Fractionation). Die größten Herausforderungen sind nach wie vor:

  • Active Solvent Modulation (ASM) – also die Veränderung der Zusammensetzung des Eluats aus der 1. Dimension, bevor es in die zweite Säule gelangt.
  • Stationary Phase Assisted Modulation (SPAM) – vereinfacht: Mithilfe einer Trap-Säule werden nur bestimmte Komponenten in die zweite Säule geführt.
  • Die Kombination von 2D- oder 3D-Systemen mit IMS/HRMS.
  • Und nicht zuletzt als 2. Dimension ein Trennmedium, bestehend aus Hunderten von Kanälen, routinetauglich gestalten. Natürlich durfte STAMP (Separation Technology for A Million Peaks) nicht fehlen. Meine Einschätzung: Hier sprechen wir nicht von nur drei oder fünf Jahren, bis marktreife Produkte gekauft werden…    

IoT, Internet of Things: Ist aus anderen Bereichen längst bekannt und auch bereits in Produkten implementiert. Die instrumentelle Analytik hinkt hier ordentlich hinterher, aber immerhin, langsam passiert etwas. So wurden von Shimadzu Smart-Ansätze vorgestellt, z. B. mit Warnung, wenn nicht genügend Eluent vorhanden ist; im Falle von Luftblasen wird erneut injiziert und der Lauf wiederholt; Überwachung des Flusses und bei Bedarf automatische Justierung; einen Monat vor einem notwendig gewordenen Austausch eine entsprechende Meldung geben etc.

Data Sciences: Auch auf diesem Gebiet mischt die Analytik nicht gerade ganz vorne mit, gleichwohl gibt es hier schon Ansätze. In den nächsten Jahren wird das Thema mehr Aufmerksamkeit erlangen. In Vorträgen wurden aus Forschungsprojekten die Möglichkeiten von Big-/Smart Data, Machine Learning, Artificial Intelligence (AI), Inverse AI dargelegt. Die Herausforderung ist einerseits die enorme Datenmenge zu managen und andererseits aus Daten Informationen zu generieren. So erzeugt z. B. eine LC-DAD-Kopplung 100 kB, bei der LC x LC-HRMS sind es bereits 15 GB, und es wird prognostiziert, dass in ein bis zwei Jahren die Herausforderung 40 Zettabytes lauten wird.

Multidetektion: Ob in der UHPLC, Chip-LC, 2D-LC oder SFC: Die Multidetektion entwickelt sich immer mehr zu einer Selbstverständlichkeit. Neben DAD-MS immer häufiger: serielle Kopplung oder nach einem Splitt FLD und MS bzw. DAD-CAD und MS. Und wenn es „nur“ MS sein soll, dann, je nachdem, APCI und ESI (gute Empfindlichkeit und gute Linearität) oder IMS und QTOF; wenn nur ESI, dann auf jeden Fall Messung bei ESI positiv und ESI negativ.

Biomoleküle: An früherer Stelle meines Berichts wurde bereits auf die zunehmende Bedeutung von Biomolekülen hingewiesen – insbesondere gilt dies für monoklonale Anti­körper (mAbs) und Glycane. Daraus ergibt sich, dass alle modernen Techniken Biomoleküle als deren „Objekt“ entdeckt haben, z. B. UHPSEC, SEC x SEC-MS für intakte mAbs, HILIC-FLD-MS für Glycane, LC x LC-MS zur Überprüfung der Vergleichbarkeit von Original-mAbs und Biosimilars usw. .

HILIC und SFC: Der Trend setzt sich fort: Um HILIC ist es etwas ruhiger geworden, im Vordergrund steht eher die SFC. Hier dreht sich die Diskussion um die stattfindenden Mechanismen, des Weiteren nimmt die Zahl der Anwendungsfelder zu. Beide Techniken können vor allem in 2D-Anwendungen ihren Charme voll entfalten. Das Befassen mit 2D-Trennungen „katalysiert“ auch jene Haltung, dass nämlich RP, HILIC, SFC, IEC, SEC usw. weniger als isolierte „Entities“ zu betrachten oder gar in der Konkurrenz zu sehen sind. Vielmehr soll es ausschließlich um eine „gute“ Trennung bzw. einen guten Informationsgewinn gehen; man sollte flexibel aus der Trenntechniken-Klaviatur 'mal dies, 'mal das aussuchen – und bei Bedarf das ein oder andere vorbehaltlos kombinieren. Diese Denkweise ist verwandt mit dem Lebenszyklus-Modell, das seit einiger Zeit in der Pharmazeutika-Entwicklung intensiv diskutiert wird (s. u.).

Bewegung im regulierten Bereich (Pharma): Vereinfacht stellt sich die Situation in der „Pharma“ heute wie folgt dar: Viele Monographie-Methoden sind schlecht, die Anforderungen aus analytischer Sicht oft nicht sinnvoll. Wiederholmessungen, penibles Einhalten von Methodenparameter und der Fokus auf Formalien bescheren Unflexibilität sowie einen vermeidbaren zeitlichen/personellen Aufwand. Das ist hinreichend bekannt; es gibt Bestrebungen für einen Wechsel der Denk- und Handlungsweise. Folgendes fand ich bei der Tagung interessant: Im Vergleich zu früher gab es mehrere Vorträge von Vertretern der Hersteller, der Pharmafirmen und auch der USP (US-Pharmakopöe), die einen neuen, pragmatischen, praxisnahen Geist propagieren. Ich kann an dieser Stelle nur stichwortartig Beispiele nennen: Ohne Re-Validierung kann man nicht nur eine andere C18-Säule, sondern auch eine Core Shell C18 verwenden – solange die Anforderungen des Systemeignungstests erfüllt sind.

  • Fundiertes Wissen um die Charakteristika der Methode (Robustheit und Risikobewertung) steht bereits bei der Methodenentwicklung im Vordergrund. Hier sollten mithilfe kommerzieller Software In-silico-Lösungen verstärkt angewandt werden (QbD, DoE, Peak Fitting, Fourier Dekonvolution etc.)
  • Ergebnisse sollen während des gesamten Lebenszyklus' der Methode überwacht werden (Monitoring).
  • Begriffe wie „Stabilität“, „Methodenfähigkeit“, „kontinuierliche Überwachung“, „Method­ Operable Design Region (MODR)“, „Critical Method Parameter“ (CMP), „Continuous Method Verification (CMV)“ usw. sind Belege von folgenden Vorstellungen:
  • Qualität in die Methode hinein stecken und nachher nicht prüfen.
  • Das Wissen um die Methode (Änderung-Auswirkung) erlaubt in der späteren Routine flexibles Handeln.
  • „Analytical Method Lifecycle“: Vereinfacht steckt folgende Philosophie dahinter: DoE-Experimente und In-silico-Tools helfen die Methode während der Entwicklung richtig zu „verstehen“; während dieser Zeit wird der „method range“ validiert. Durch kontinuierliche Leistungsverifizierung (Continuous Performance Verification, CPV) wird anschließend abgesichert, dass die Methode während des gesamten Lebenszyklus' noch ISK (In statistischer Kontrolle) ist. Methodenentwicklung, Validierung und Routineanwendung sollen nicht mehr als drei zeitlich hintereinander geschaltete, voneinander unabhängige Schritte verstanden werden.

Zum Schluss noch eine kurze Vorstellung einiger Produkte, die mir ins Auge gefallen sind (teilweise handelt es sich um bereits länger existierende Produkte).

  • Paper-Spray-Ionisation: Ein paar Mikroliter Blut oder Urin werden auf Papier oder auf einen Objektträger aufgebracht, mit Lösungsmittel versetzt und es werden MS-Spektren aufgenommen; Ergebnis:  Quantitative Info innerhalb 60 s;
  • „Dursan“: CVD (Chemical Vapor Deposition)-Beschichtung, chemisch inert, keine Physisorption von Proteinen, temperatur-  und pH-Wert-stabil (silcotek.de);
  • Core-Shell-Technologie für Biomoleküle, z. B: YMC-Triart Bio C4 (Hybrid-Material, 1,9 µm, YMC), BIOshell IgG 1 000 Å C18 bzw. Diphenyl sowie Chromolith WP 300 mit diversen funktionellen Gruppen (Merck);
  • Supelco (also Merck) stellte ein Core-Shell-Material mit einer PGC-Schicht (Porous Graphite Carbon) für die Trennung von sehr polaren Substanzen vor;
  • GPC Clean-Up-System für die Probenvorbereitung durch Verwendung zweier Säulen, Clean-Up von größeren Mengen einer schwierigen Matrix, beispielsweise von Öl (Knauer).

Die nächsten HPLC-Tagungen finden 2020 in San Diego und 2021 in Düsseldorf statt.

AUTOR
Dr. Stavros Kromidas
www.kromidas.de

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