Molekularbiologischer Nachweis

Clostridium botulinum in Nahrungsmitteln

2009 rettete die Gabe von Botulinum-Antitoxin einer 49-jährigen Frau in Sachsen-Anhalt das Leben. Erst die rechtsmedizinische Untersuchung des Todes ihrer 23-jährigen Tochter kurz zuvor ließ den Verdacht auf Botulismus aufkommen, der auf eine gemeinsame Mahlzeit aus selbst eingelegten Heringen zurückgeführt werden konnte. Aus deren Resten ließen sich neurotoxinbildende Stämme des Bakteriums Clostridium botulinum nachweisen.

Laut Robert Koch-Institut (RKI) hatten die Ärzte der Klinik die Vergiftung vermutlich deshalb nicht erkannt, weil es im Landkreis seit mehr als 30 Jahren keine Botulinum-Intoxikation mehr gegeben hatte. In der Tat sind derartige Fälle selten, die Sterblichkeitsrate bei Betroffenen liegt mit 30 bis 50 % jedoch sehr hoch, da es sich bei Botulinum-Neurotoxin (BoNT) um die giftigste bisher bekannte natürliche Substanz handelt.

Es ist daher besonders wichtig, dass Hersteller bei Produkten wie Honig für Säuglingsnahrung und vakuumverpackte Lebensmittel Analysen durchführen lassen. Im Verdachtsfall ist der sichere Nachweis des Gifts jedoch nur im Tierversuch möglich. Der direkte Nachweis der Bakterien ist sehr aufwändig und schwierig.

Das molekularbiologische Labor der LADR GmbH in Geesthacht bietet ein Verfahren an, das diese Nachteile nicht hat: Mittels kommerzieller Real-Time-PCR können Toxin-Gene von C. botulinum nachgewiesen werden. Bei einem positiven Ergebnis ist die Bildung des Gifts durch das Bakterium im betroffenen Lebensmittel möglich.

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Die Skala zeigt die letalen Dosen von Kaliumcyanid, Nicotin, TCDD, Ricin und Botulinum-Toxin, bei denen 50 % der Versuchstiere starben. Bei Botulinum-Toxin reichen wenige Mikrogramm aus, um einen erwachsenen Menschen zu töten. (Alle Bilder: LADR GmbH MVZ Dr. Kramer und Kollegen)

Toxische Lebensmittel
Wie andere Arten von Clostridien kommt auch Clostridium botulinum weltweit natürlich im Boden sowie in den Sedimenten von Gewässern und Meeren vor. Durch Staub- und Erdpartikel kann das grampositive, obligat anaerobe Bakterium auch auf Lebensmittel gelangen. Keimen die Sporen aus und vermehrt sich C. botulinum vom Typ A, B, E oder F dort, können auch die Neurotoxine (BoNT) gebildet werden.

Solche toxinhaltigen Lebensmittel sind lebensgefährlich: Werden sie verzehrt, führt dies zu Vergiftungserscheinungen, dem sogenannten Botulismus. „C. botulinum Typ E steht meist mit dem Verzehr von rohem oder ungenügend erhitztem Fisch in Zusammenhang. Die Ostsee gilt als eine der am höchsten kontaminierten Gegenden weltweit für diesen Clostridien-Stamm. Etwa 4 % untersuchter Ostsee-Heringsproben enthalten C. botulinum Typ E“, erläutert Dr. Burkhard Schütze, Leiter des Bereichs Lebensmittelanalytik bei der LADR GmbH in Geesthacht bei Hamburg.

Es ist besonders wichtig, dass Hersteller bei Produkten wie Honig für Säuglingsnahrung und vakuumverpackten Lebensmitteln Analysen durchführen lassen. LADR bietet hier ein besonders elegantes olekularbiologisches Verfahren an: die kommerzielle Real-Time-PCR zum Nachweis der Toxin-Gene von C. botulinum.

Das Neurotoxin BoNT ist extrem toxisch und der giftigste bisher bekannte natürlich vorkommende Stoff. Da er die Schlüsselproteine der Reizleitung in den Nervenzellen zerstört, tritt ohne eine schnelle Gabe von Antitoxinen der Tod durch Atemlähmung oder Herzstillstand ein. Das Antitoxin neutralisiert frei im Blut zirkulierendes Gift, ist jedoch unwirksam, wenn das Gift bereits an den Nervenstrukturen gebunden ist. Daher spielt bei einer verdächtigen Erkrankung die Zeit bis zur Diagnose eine extrem wichtige Rolle. Die Hauptsymptome der Erkrankung sind Erbrechen, Durchfall, Atemnot, Schluckbeschwerden sowie Seh- und Motorikstörungen. Laut RKI wurde seit 2001 von 80 Fällen von lebensmittelbedingtem Botulismus berichtet.

Intestinaler Botulismus
Eine Sonderform stellt der intestinale Botulismus bei Kleinstkindern dar. Gut untersucht ist hier der Weg über Honig, der von Natur aus mit wenigen Sporen (<100 Sporen/kg) von Clostirdien wie beispielsweise C. botulinum kontaminiert sein kann. Da bei Säuglingen die Magensäureproduktion noch nicht ausreichend ist, können Sporen in den Darm gelangen, auskeimen, sich vermehren und Botulinum-Toxin produzieren. Wie bei Erwachsenen wird das Gift resorbiert und gelangt zu den Nervenzellen. Erwachsene sind dank ihres Immunsystems, der Magensäure und ihrer größeren Körpermasse im Verhältnis zu Säuglingen i.d.R. durch Honig nicht gefährdet.

Bei der Real-Time-Multiplex-PCR werden Fluoreszenzsignale gemessen. Wird ein Toxin-Gen repliziert, steigt das Signal exponentiell an. Der Nachweis auf DNA-Ebene ist damit erbracht.

Aufgrund der hohen Sterblichkeitsrate bei Botulismus sind Untersuchungen auf Anwesenheit oder Abwesenheit von C. botulinum bei gefährdeten Lebensmitteln wie Honig, Säuglingsnahrung, Konservendosen, dem Inneren von Fleisch- und Fischwaren oder vakuumverpackten Lebensmitteln wie Räucherfisch und Wurstwaren von besonderem Interesse. Allerdings erfolgt die Überprüfung der Lebensmittel auf Clostridium botulinum routinemäßig eher selten. Häufiger lassen Lebensmittelhersteller lediglich überprüfen, ob ihre Produkte frei von Sulfit reduzierenden Clostridien sind. „Es ist einfach nicht so bekannt, dass ein elegantes molekularbiologisches Verfahren zur Bestimmung des Vorhandenseins oder des Nicht-Vorhandenseins der Toxin-Gene von Clostridium botulinum existiert“, sagt Schütze.

Der direkte Nachweis des Bakteriums ist im Labor unzweifelhaft sehr aufwändig: „Der Nachweis von Clostridium botulinum gemäß § 64 LFGB ist nach der Methode 06.00-26 durchzuführen. Das Untersuchungsverfahren umfasst viele Einzelschritte und dauert bis zur Isolation von Reinkulturen eine Woche und länger“, erklärt Schütze.

Der sichere Toxinnachweis ist aus Serum, Erbrochenem oder Lebensmittelresten nach wie vor nur im Tierversuch, mit dem sogenannten Toxin-Mäusetest möglich. „Dabei injiziert man aufbereitete erhitzte und nichterhitzte Homogenate des verdächtigen Lebensmittels und Extrakte aus Anreicherungs- und Reinkulturen an Mäuse und beobachtet die Versuchstiere“, so Schütze. Sterben daraufhin die Tiere, denen die nichterhitzten Homogenate injiziert wurden, mit den typischen Symptomen und überleben Vergleichsgruppen, die mit Antitoxin geschützt wurden, gilt dies als Nachweis für das Vorhandensein von BoNT in der Probe.

Bei der Real-Time-Multiplex-PCR werden Fluoreszenzsignale gemessen. Wird ein Toxin-Gen repliziert, steigt das Signal exponentiell an. Der Nachweis auf DNA-Ebene ist damit erbracht.

Dieser Nachweis ist Bestandteil der amtlichen Methode und wird in Dienstleistungslaboren nicht durchgeführt. „Im Verdachtsfall von Botulismus sind Toxin-Untersuchungen nötig; hier ist jedoch in erster Linie das Konsiliarlabor für Clostridium botulinum am RKI gefragt“, so Schütze. Dort können auch immunologische und spektrometrische Verfahren zum Toxin-Nachweis durchgeführt werden.

Vereinfachter Nachweis mit Real-Time-PCR
War die mikrobielle Anzucht der Clostridien-Spezies aus den entsprechenden un- tersuchten Lebensmitteln erfolgreich, so besteht die Möglichkeit, die isolierten Bakterienkolonien mittels 16S-rRNA-Gensequenzierung zu identifizieren. Molekularbiologisch ist hier jedoch aufgrund von Sequenzhomologien eine Unterscheidung zwischen Clostridium botulinum und Clostridium sporogenes nicht eindeutig möglich. Werden andere Clostridien-Arten ermittelt, liegt zumindest C. botulinum nicht vor. Die Sequenzierung ist verhältnismäßig teuer und kann nur von Speziallabors wie die LADR in Geesthacht durchgeführt werden.

Als Alternative dazu können zur Einschätzung des Risikos einer vermeintlichen Toxin-Bildung durch C. botulinum auch weitere schnellere, molekularbiologische Verfahren herangezogen werden. Mit diesen ist es möglich, in Lebensmitteln die für den Menschen gefährlichen Clostridium botulinum-Toxintypen A, B, E oder F über die Toxin- Gene (bont A, B, E, F) nachzuweisen. LADR führt hier das Real-Time-Multiplex-PCR-Verfahren durch:

„Der Nachweis von Clostridium botulinum gemäß § 64 LFGB ist nach der Methode 06.00-26 durchzuführen. Das Untersuchungsverfahren umfasst viele Einzelschritte und dauert bis zur Isolation von Reinkulturen eine Woche und länger“, so Dr. Burkhard Schütze, Laborleiter Lebensmittelanalytik bei der LADR GmbH (E-Mail: lebensmittel@ladr.de, Internet: www.ladr-lebensmittel.de).

„Dafür wird zuerst eine für Clostridien geeignete anaerobe kulturelle Anreicherung durchgeführt. Anschließend erfolgt die DNA-Extraktion aus der TPGY-Anreicherungsbouillon und anschließend wird die Multiplex-PCR der Toxin-Gene A, B, E und F durchgeführt“, erklärt Schütze. Fällt diese Untersuchung negativ aus, konnten folglich die Toxin-Gene von C. botulinum nicht nachgewiesen werden. Die Lebensmittel sind also nicht mit C. botulinum-Stämmen, die zur Toxin-Produktion befähigt sein könnten, belastet. Werden hingegen die Toxin-Gene nachgewiesen, besteht die Möglichkeit, dass die vorhandenen C. botulinum-Bakterien unter geeigneten Bedingungen auch tatsächlich die gefährlichen Toxine bilden könnten.

„Bei einem positiven PCR-Ergebnis wird zudem ein Ausstrich aus der TPGY-Anreicherungsbouillon gemacht. Nach 48 Stunden und unter anaeroben Bedingungen werden verdächtige Kolonien im Eigelb-Lactose-Agar und im Blut-Agar erneut mittels Real- Time-PCR untersucht“, so Schütze. Dabei wird eine zweite Real-Time-PCR der Toxin-Gene A, B, E und F durchgeführt. Werden auch hier die Toxingene „nachgewiesen“, bedeutet das, dass sich in der Lebensmittelprobe lebensfähige und zur Toxin-Bildung befähigte Clostridium-botulinum-Bakterien befinden. Grundsätzlich gilt bei einem positiven Testergebnis, dass hier ein Umgang mit dem Lebensmittel im Sinne der Lebensmittelsicherheit für den Verbraucher maßgeblich ist und entsprechende Maßnahmen eingeleitet werden müssen.

Vorsicht bei Bombagen
Trotz der Labortests, die die Hersteller in Auftrag geben, sollten Verbraucher bei Risiko-Lebensmitteln – wie beispielsweise säurearmen Konserven, insbesondere mit selbst eingekochtem Fleisch, Fisch und Gemüse, vakuumverpacktem Knochenschinken und Räucherfisch – große Vorsicht walten lassen. Dies zeigt auch der Fall der beiden Frauen aus dem Landkreis Stendal, die von einem selbstgemachten und nicht ausreichend gesäuerten Heringstopf aßen.

Honig ist in diesem Zusammenhang nicht als Risikolebensmittel einzustufen, aber Säuglinge unter einem Jahr sollten keinen Honig verzehren. Im Supermarkt findet sich auf Honig deshalb in der Regel der Hinweis: Honig ist naturbelassene Rohkost und daher für Kinder unter zwölf Monaten ungeeignet.

„Betroffene Lebensmittel müssen nicht unbedingt geschmacklich verändert sein“, warnt Schütze. „Nicht alle C. botulinum-Stämme besitzen Proteasen oder Lipasen. Auch die Gasbildung ist nicht obligat.“ Wenn es allerdings bei Konserven schon zu einer Bombage und bei Einweckgläsern zu einem selbsttätigen Öffnen gekommen ist, sollten vom Lebensmittel nicht einmal mehr kleinste Mengen probiert, sondern es sofort entsorgt werden. Grundsätzlich ist zu empfehlen, dass selbst eingewecktes Gemüse oder Fleisch zweimal erhitzt, also tyndalisiert wird. Die eventuell gebildeten Toxine von Clostridum botulinum und vegetative Bakterien werden im ersten Schritt durch die Hitze zerstört. Ausgekeimte Sporen werden erst im zweiten Schritt abgetötet.

Fazit
Da kommerziell hergestellte Konserven als sicher gelten, ist die Gefahr, an Botulismus zu erkranken, heutzutage sehr gering. Dennoch stellt die Untersuchung der genannten Risiko-Lebensmittel auf die Toxin-Gene von Clostridium botulium ein schnelles und geeignetes Verfahren dar, um die Lebensmittelsicherheit zu erhöhen.

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