Proteinquantifizierung

Variable Fenster für die Quantifizierung

Die Entwicklung der SWATH ® -Akquisition hat die Proteinquantifizierung verbessert – u.a. dank der 100-variable-Fenster-Methode.

SWATH®-Akquisition

Die SWATH ® -Akquisition vereinigt die Qualität der Quantifizierung von zielgerichteten Analysen mit dem hohen Maß an Multiplexing der datenabhängigen Akquisitionsmethode (DDA). Seit der ersten Beschreibung und Kommerzialisierung im Jahr 2012 gab es erhebliche Fortschritte durch ein verbessertes Verständnis der Messmethodenoptimierung und Datenprozessierung für Large-scale-Proteinquantifizierungsexperimente – unter anderem durch den „100 variable Fenster“-Ansatz.

Die datenunabhängige Akquisitionsmethode (DIA), genannt „SWATH®-Akquisition“ (Sequential Window Acquisition of all Theoretical spectra) wurde erstmals im Jahr 2012 beschrieben und kommerzialisiert. In dieser ersten Implementierung wurde ein 25 Da breites Quadrupol1-(Q1-)Isolationsfenster schrittweise über den gesamten Massenbereich der Peptidvorläufermassen geführt, wobei in jedem Schritt MS/MS-Daten in hoher Auflösung gesammelt wurden. Mit Hilfe von Peptidspektren-Biblio-theken, auch Ionen-Bibliotheken genannt, wer- den aus den resultierenden Spektren sogenan- nte Fragmentionen-Chromatogramme (XIC) extrahiert und den daraus resultierenden Peptiden bzw. Proteinen zugeordnet. Dies wiede- rum erlaubt eine reproduzierbare Quantifizierung derselben anhand der XICs. Die SWATH®-Akquisition vereinigt dabei die Qualität der Quantifizierung von zielgerichteten Analysen wie z.B. Multiple Reaktion Monitoring (MRM, SRM), mit dem hohen Maß an Multiplexing der datenabhängigen Akquisitionsmethode (DDA).

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Seit dieser ersten Beschreibung gab es erhebliche Fortschritte durch ein verbessertes Verständnis der Messmethodenoptimierung und Datenprozessierung für large scale Pro- teinquantifizierungsexperimente. Innovatio-nen in der Datenaufzeichnung, Verbesserungen der Messinstrumente sowie Fortschritte in der Bibliotheken-Herstellung einerseits und eine starke Erweiterung der Anwendungsbereiche andererseits führten insgesamt zu den heute geläufigen verfeinerten Arbeitsabläufen.

Bild 1: Verbesserung der Protein- und Peptidquantifizierung durch SWATH®-Innovationen. Vergleich zwischen der ursprünglichen SWATH®-Methode mit kleiner Bibliothek, einem intermediären Ansatz und der optimalen Strategie von 100 variablen Fenstern mit einer großen Bibliothek, wobei die meisten anderen Parameter konstant gehalten werden. Ein Anstieg der Quantifizierungen von über 300 % für Peptide und 120 % für Proteine wurde in wiederholten Messungen gefunden. (Alle Abbildungen: Sciex)

Im Folgenden werden die technologischen Verbesserungen in der SWATH®-Methodologie näher beschrieben. Bei der Entwicklung wurden, soweit möglich, variable Parameter wie Chromatographie, MS-Instrument und Probenmenge konstant gehalten. Mit durchgehend aufeinanderfolgenden Probenmessungen konnte so eine gute Bewertung der Einflüsse der relevanten Messparameter erhalten werden (Bild 1).

Verglichen mit der 2012 verwendeten Methode (34 Q1-Fenster mit konstanter Breite á 25 Da mit einer kleinen Bibliothek), erreicht die Methode mit 100 variablen Fenstern sowie einer großen Spektren-Bibliothek eine erhebliche Verbesserung der Anzahl an quantifizierten Proteinen und Peptiden (100 % mehr Proteine und 300 % mehr Peptide quantifiziert) (siehe Kasten).

Zentrale Fortschritte der SWATH®-Methode

  • Variables Q1-Fenster
    - Verbesserung der Spezifität und Quantifizierung durch Verwendung einer höheren Zahl Q1-Fenster mit kleinerem Massenbereich.
    - Optimierung der Q1-Fensterbreite, basierend auf der m/z-Dichte von Vorläufermolekülen, führt zu verbesserter Spezifität bei gleichzeitiger erhöhter Massenbereich-Abdeckung.
  • Massenspektrometer [3]: Die Möglichkeit, MS/MS-Daten in hoher Auflösung (~30,000 Auflösung) und mit hoher Geschwindigkeit und Dynamikbereich aufzuzeichnen, ist für DIA unverzichtbar.
  • Bibliotheken-Erstellung [4, 5]: Die mehr-dimensionale Probenfraktionierung für die Herstellung von umfassenderen Ionenbi-bliotheken ist entscheidend für die Maximierung von quantitativen Informationen aus SWATH®-Daten.
  • „Industrialisierung“ des Arbeitsablaufs durch den Einsatz von Mikrofluss-Chromatographie [6] bietet eine höhere Robustheit und Messdurchsatz für die Durchführung von Studien mit großen Probenzahlen.
Tabelle 1: Relevante Parameter der SWATH®-Methoden. Vier verschiedene SWATH®-Akquisitionsmethoden wurden für die Analyse eines Zelllysats verwendet, um den Einfluss der verschiedenen Methoden auf die Quantifizierung zu ermitteln. Der LC-Gradient, Instrument und Probenmenge wurden dabei konstant gehalten. * Eine Methode mit 20 Fenstern mit je 20 Da Breite über einen engen Massenbereich wird gegenwärtig auf anderen DIA-Instrumenten verwendet und wurde hier zum Vergleich gezeigt. Es wurden 125 ms Akkumulationszeit eingestellt, um eine mit den anderen Methoden vergleichbare Zykluszeit zu erhalten.

Methoden
Chromatographie: Die chromatographische Trennung eines trypsinverdauten Human-Zelllysats wurde auf einem NanoLC™ 425 System (Sciex) im trap-elute Modus bei Mikroflussraten durchgeführt. Zur Trennung wurde eine 0,3 x 150 cm ChromXP™ Säule (Sciex) mit einem kurzen Gradienten verwendet (4-32% Acetonitril in 43 min in 0,1% Ameisensäure) mit einer Flussrate von 5 µl/Min (Gesamtlaufzeit 57 min [6]). Die insgesamt auf die Säule aufgetragene Menge des Proteinverdaus betrug 5 μg.

Massenspektrometrie: Die MS-Messungen wurde auf verschiedenen TripleTOF®6600 bzw. 5600 Systemen (Sciex) ausgeführt, jeweils mit einer Turbo V Quelle und einer 25 μm I.D. Hybrid Elektrode (Sciex) ausgestattet. Variable-SWATH®Fenster-Methoden wurden mit der Analyst TF Software 1.7. erstellt. Vier verschiedene SWATH®-Methoden mit unterschiedlichen Fenster-Strategien wurden verglichen (Tabelle 1).

Datenverarbeitung: Injektions-Replikate der jeweiligen Messmethoden wurden mit drei verschiedenen Bibliotheken mit SWATH®2.0 in PeakView® Software 2.2 prozessiert (Tabelle 2). Nicht proteinspezifische Peptide wurden von der Quantifizierung ausgeschlossen. Die Analyse der Ergebnisse wurde in MS-Excel mittels der SWATH®Acquisition Replicates-Vorlage ausgeführt [7]. Als Ergebnis wurde die Anzahl der quantifizierten Proteine bzw Peptide bei <1% Falsch Positiv Rate (FDR) und bei <20% Variationskoeffizient (CV) über fünf SWATH®-Replikate ermittelt.

Bild 2: Verkleinerung des Q1-Isoliationsfensters bei SWATH®-Akquisition verbessert die Spezifität. In diesem Beispiel wurde die gleiche Probe wiederholt auf einem TripleTOF®-6600-System analysiert – einmal mittels einer SWATH®-Akquisition mit fester 25-Da-Fensterbreite (links, 75 ms Akkumulationszeit) und ein weiteres Mal mit einer SWATH®-Akquisitionsmethode mit variabler Fenstergröße und 100 Fenstern (rechts, 25 ms Akkumulationszeit). Das Signal-Rausch-Verhältnis der Signalgruppe des detektierten Peptids ist, dank der viel kleineren Q1-Fenstergröße der variablen-Fenster-Methode, deutlich verbessert.

Höhere Anzahl kleinerer Fenster verbessert Spezifizität erheblich
Eine der wichtigsten Verfeinerungen der SWATH®-Methode ist die Nutzung von Q1 Isolationsfenstern mit variabler Breite. Durch die Optimierung der Q1-Fenstergrößen anhand der Häufigkeitsverteilung der Vorläufermassen in der m/z-Dimension [2] können viel kleinere Fenster in Regionen hoher Peptidvorläuferdichte verwendet werden, was zu einer signifikanten Verbesserung in der Spezifität der Daten für die ausgewählten Peptide führt. Dementsprechend können in den m/z-Bereichen, in welchen weniger Peptid-Vorläufermassen auftreten, größere Fenster verwendet werden, um so eine gute Abdeckung des Proteoms beizubehalten.

Um dieses zu testen, haben wir auf verschiedenen TripleTOF-Systemen eine Reihe von Messungen mit zunehmend kleineren Q1-Fenstern durchgeführt und diese Daten mit jenen der ursprünglichen 25-Da-Fenster-Strategie verglichen (Tabelle 1).

Bild 3: Anstieg an quantifizierten Peptiden unter Anwendung von verschiedenen SWATH®-Akquisitionsmethoden und Ionen-Bibliotheken. Dargestellt ist die Anzahl der Peptide, die über fünf Injektionsreplikate mit <1% FDR detektiert und mit <20 % CV quantifiziert wurden. Tryptisch verdaute HEK-Zellen-Lysate wurden mit drei verschiedenen SWATH®-Akquisitionsmethoden gemessen (34 Fenster mit 25 Da Breite (34 fx x 25 Da), 60 variable Fenster und 100 variable Fenster). Die Messungen wurden jeweils mit drei verschieden großen Ionenbibliotheken prozessiert, und die resultierende Anzahl quantifizierter Peptide aus allen Tests wurde in Bezug auf die ursprüngliche 34-feste-Fenster-Methode mit kleiner Bibliothek dargestellt. Bei Verwendung eines einzigen Bibliotheken-Typs wurde eine stetige Steigerung der quantifizierten Peptidzahlen mit der steigenden Anzahl an Fenstern beobachtet. Darüber hinaus zeigt der zusätzliche Vergleich zwischen den Bibliotheken untereinander eine Verbesserung der Resultate mit Bibliotheksgröße. Insgesamt wurden durch diese Innovationen des SWATH®-Workflows erhebliche Verbesserungen der Peptidquantifizierungen erreicht.

Um die Effekte der unterschiedlichen Methoden auf die Datenspezifität abzuschätzen, wurden die XICs der gleichen Peptide zwischen den verschiedenen Methoden nach Datenextraktion miteinander verglichen (Bild 2). In vielen Fällen wurde mit der 100-variable-Fenster-Methode eine wesentlich verbesserte XIC-Spezifität im Vergleich zu der originalen 25-Da-Fenster-Methode beobachtet.

Verbesserte Peptidquantifizierung mit größerer Fensteranzahl
Wie erwartet hatte die Verwendung kleinerer und höherer Anzahl von Q1-Fenstern einen erheblichen Einfluss auf die Anzahl der von den Replikat-Daten reproduzierbar quantifizierbaren Peptiden und Proteinen. Ein Vergleich zwischen den verschiedenen Datenbanken innerhalb der SWATH®-Messung mit 25 Da Fensterbreite und 34 Fenstern erzielte einen 70-100 %igen Anstieg in der Zahl quantifizierter Peptide bei Verwendung einer panhumanen Bibliothek [5] (PHL) (Bild 3, gefüllte Balken). Noch weitere Verbesserungen in der Quantifizierung werden (110-150 % Peptidanstieg) bei Verwendung von 100 variablen Fenstern erzielt. Diese erheblichen Zugewinne sind hauptsächlich auf verbessertes Rauschsignal (S/N) bei vielen quantitativen Peptid-XICs zurückzuführen (Bild 2).

Tabelle 2: Humane Swath®-Ionenbibliotheken. Mehrere Ionenbibliotheken von wachsendem Umfang wurden für die Untersuchung der Swath®-Daten hergestellt (mit 1 % FDR und Ausschluss modifizierter und gemeinsamer Peptide).

Bemerkenswerterweise findet man bei Verwendung einer kleineren 1D-Bibliothek nur sehr viel geringere Anstiege (Bild 3, punktierte Balken). Hier wurde mit 60 variablen Fenstern lediglich ein Anstieg von 40-50% bzw. 70-80% mit den 100 variablen Fenstern gegenüber der ursprünglichen Methode mit festen 25 Da breiten Q1-Fenstern gefunden.

Um diesen Zusammenhang genauer darzulegen, wurde die Anzahl an quantifizierten Peptiden mit dem Datenbanktyp für die verschiedenen SWATH®-Methoden korreliert (Bild 4). Es zeigte sich, dass es auch bei der Verwendung von SWATH®-Methoden mit 60 oder 100 variablen Fenstern empfehlenswert ist, größere Bibliotheken zu verwenden, um die Menge an hochwertigen quantitativen Daten zu maximieren.

Bild 4: Zusammenhang der Anzahl quantifizierter Peptide von der Größe der Ionenbibliotek und SWATH®-Akquisitionsmethodik. Die Grafik stellt den Zusammenhang zwischen der Anzahl an quantifizierten Peptiden und den verschiedenen Akquisitionsstrategien dar, bei jeweiliger Anwendung der verschiedenen Bibliotheken. Das Ergebnis unterstreicht die Bedeutung einer umfassend quantitativen Information erzeugenden Akquisitionsmethode, deren verbesserte Datenqualität erst durch Einsatz einer größeren Ionenbibliothek in vollem Umfang zur Geltung kommt.

Die beobachteten Anstiege waren weitgehend konsistent zwischen den TripleTOF®-6600- und -5600-Systemen. Es bestätigt sich damit, dass die 100-variable-Fenster-Strategie optimal für die Messung von komplexeren Proteomen mittels SWATH®-Technologie geeignet ist.

SWATH® im Vergleich mit anderen DIA-Strategien
Abschließend wurde eine zusätzliche Messmethode verglichen, welche von anderen akkuraten Massenspektrometern verwendet wird, deren MS/MS-Messfrequenz niedriger liegen als die eines TripleTOF®-Systems. Hier wird üblicherweise eine Methode mit 20 Fenstern von jeweils 20 Da Breite verwendet, welche nur einen begrenzten Messbereich mit einer Bandbreite zwischen m/z 500-900 abdeckt, in welchem die meisten Peptide liegen. Die Begrenzung des Messbereiches ist notwendig um die Zykluszeit kurz halten zu können, und so für eine Quantifizierung genügend Datenpunkte über die Signalpeaks zu ermöglichen. Dieses Konzept zielt darauf, ausreichend Peptide in dem kleineren Massenbereich zu finden, um so die Mehrzahl an Proteinen darzustellen. Wie in Bild 5 ersichtlich, liegt dieser Ansatz jedoch in Bezug auf die Anzahl quantifizierter Peptide deutlich hinter den SWATH®-Methoden mit 60 bzw. 100 variablen Fenstern.

Bild 5: Zuwachs an quantifizierten Proteinen unter Anwendung vier verschiedener DIA-Methoden. Auf Protein-Ebene wurden mit über 3500 quantifizierten Proteinen signifikante Zuwächse verzeichnet, wenn die Anzahl der Fenster erhöht wird (bei verkleinerter Q1-Fenster-Größe). Die Geschwindigkeit der hochauflösenden MS/MS-Akquisition ist dabei ein entscheidender instrumenteller Faktor für die Durchführung von DIA mit einer hohen Fensteranzahl.

Zusammenfassung
Die SWATH®-Methode der datenunabhängigen Akquisition wurde schnell von denjenigen Wissenschaftlern in der biologischen Forschung und speziell in der Biomarker-Forschung angenommen, die eine robuste und umfassende Proteinquantifizierung benötigen. Mittlerweile ist die SWATH®-Technologie mit dem HUPO-Award ausgezeichnet worden (s. https://www.hupo.org/page-1757209).

In den fünf Jahren seit ihrer Einführung ist die Datenqualität der SWATH®-Akquisitionsmethode durch Innovationen in der Hardware, in der Akquisitionsmethode und durch Entwicklung der Bibliotheken signifikant verbessert worden. Verglichen mit der ursprünglichen Implementierung der SWATH®-Akquisition (34 x 25 Da mit einer kleinen Bibliothek), konnten durch den 100-variable-Fenster-Ansatz und eine umfassendere Ionenbibliothek deutliche Verbesserungen von über 100 % mehr Protein- bzw. 300 % mehr Peptidquantifizierungen erreicht werden. 

Literatur
[1] Gillet LC et al (2012) Mol. Cell. Prot. 11(6), 1-17.
[2] Improved Data Quality Using Variable Q1 Window Widths in SWATH® Acquisition, Sciex Technical Note, RUO-MKT-02-2879-B.
[3] Increasing Depth of Coverage in Data Independent Acquisition with Higher Sample Loads and Smaller Q1 Windows, Sciex Technical Note, RUO-MKT-02-3245-A.
[4] Extending Depth of Coverage with SWATH® Acquisition Using Deeper Ion Libraries, Sciex technical note, RUO-MKT-02-3247-A.
[5] Rosenberger G et al. (2014) Scientific Data, 1, 140031.
[6] Microflow SWATH® Acquisition for Industrialized Quantitative Proteomics, Sciex technical note, RUO-MKT-02-3637-A.
[7] SWATH Variable Window Calculator - Excel tool. Download from http://sciex.com/support/software-downloads

Christie Hunter, Sciex USA
Nick Morrice, Sciex UK
Joerg Dojahn, Sciex Germany
http://www.sciex.com

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