RNA-Expressionsanalyse

Screening lebender Zellen mit RNA-Detektionssonden

Die RNA-Expressionsanalyse ist ein neuer Schritt für die Biomarker-Entwicklung, da sie Hinweise über das Zellverhalten und die weitere Zellentwicklung liefert. Die mRNA-Expression kann spezifische Einblicke in die Reaktionen einer Zelle auf ihre Umgebung oder externe Umweltfaktoren sowie auf Nachbarzellen bieten. Aufgrund der mangelnden Verfügbarkeit geeigneter Detektionsmethoden konnte RNA bisher jedoch nur begrenzt zur Analyse der Zellfunktion eingesetzt werden.

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Traditionelle mRNA-Detektionsmethoden basieren auf Zelllyse und RNA-Extraktion, wodurch die RNA letztendlich denaturiert wird. Außerdem erfordern diese Methoden typischerweise eine arbeitsintensive Probenaufbereitung, Nuklein-säureaufreinigung, reverse Transkription und nachfolgende Normalisierung mittels Erstellung von Standardkurven. Auf Zellaufschluss basierte mRNA-Detektion ist mit der Untersuchung von Fossilien zu vergleichen. Fossilien können Hinweise über die Aktivität eines Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt liefern. Die beste Methode, einen biologischen Organismus zu verstehen, ist jedoch die Beobachtung des lebenden Organismus in seiner natürlichen Umgebung.

Aufgrund der Heterogenität von Zellen bewegt sich die Forschung mehr und mehr zu Einzelzellanalysen. Selbst innerhalb einer bestimmten Population homogener Zelltypen bestehen Unterschiede in der Signaltransduktion und Expression. Die Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen während der Reprogrammierung ist beispielsweise kein 100%ig effizienter Prozess und liefert ein Gemisch von Zellen. Außerdem sind Tumore extrem heterogen. Diese Heterogenität wird unter anderem durch behandlungsresistente Subpopulationen von Zellen widergespiegelt. Die Möglichkeit, mRNA-Expression in einzelnen lebenden Zellen zu untersuchen, ist daher sowohl für die Forschung als auch für klinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung.

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Bild 1: Die Aufnahme von SmartFlare™-Sonden in eine Zelle ist ein aktiver Prozess.

RNA-Detektion in einzelnen lebenden Zellen
SmartFlare™-RNA-Detektionssonden (Merck Millipore) verwenden die Technologie inerter Nanopartikel für die spezifische Detektion nativer RNA in lebenden Zellen in einem einzigen Inkubationsschritt [1]. Diese Technologie ermöglicht es Wissenschaftlern, RNA-Expression in einzelnen lebenden Zellen zu untersuchen, wobei die Zellen intakt bleiben und für nachfolgende Analysen verwendet werden können. Außerdem erfordert diese Technologie keine Manipulation oder Verwendung von Transfektionsreagenzien mit den zu analysierenden Zellen.

Die Sonden bestehen aus einem Gold- Nanopartikel, das an einen zur Ziel-RNA komplementären Capture-Strang konjugiert ist, sowie einem Reporter-Strang mit einem Fluorophor, der dem Quenching-Effekt des Goldes unterliegt. Bei Anwesenheit der Ziel-RNA und komplementärer Anlagerung an den Capture-Strang wird der Reporter-Strang verdrängt und somit ist der Quenching-Effekt aufgehoben. Es kommt infolge dessen zum Fluoreszenzsignal. Je mehr Ziel-RNA in der Zelle vorliegt, umso stärker ist das Fluoreszenzsignal.

Bild 2: SmartFlare™-Sonden sind nicht toxisch und verändern die Genexpression nicht.

Die Nanopartikel gelangen durch Endozytose in die Zelle und verlassen diese nach einer gewissen Zeit durch Exozytose (Bild 1). Die Sonden werden direkt zum Zellkulturmedium zugegeben und durch die Zelle aktiv endozytosiert. Bei Anwesenheit der Ziel-RNA in der Zelle bindet diese an den Capture-Strang der Sonde, und der frei werdende Reporter-Strang emittiert folglich ein Fluoreszenzsignal. Wenn das Medium einmal täglich gewechselt wird, sind alle Partikel nach etwa fünf bis sechs Tagen (je nach Zelltyp) aus den Zellen exozytosiert. Diese Zellen können dann für nachfolgende Analysen verwendet werden.

SmartFlare™-Sonden sind nicht toxisch und verändern die Genexpression oder -translation nicht (Bild 2). Die lyophilisierten Sonden werden mit sterilem nukleasefreien Wasser rekonstituiert, mit PBS auf die gewünschte Konzentration verdünnt, zum Zellkulturmedium hinzugegeben und über Nacht mit den Zellen inkubiert. Die RNA wird am nächsten Tag mit einem Fluoreszenzmikroskop oder Durchflusszytometer detektiert.

Bild 3. A) RT-PCR in heterogenen Populationen. Die RT-PCR kann in heterogenen Brustkrebs-Zelllinien nicht zwischen Subpopulationen mit hoher und niedriger IL-6-Expression unterscheiden.

Die richtigen Kontrollen
Alle guten Versuche werden mit geeigneten Kontrollen durchgeführt. Beim Screening lebender Zellen zur RNA-Detektion ist es wichtig, drei Versuchskontrollen zu verwenden: Uptake (Aufnahmekontrolle), Scramble (Hintergrundkontrolle) und Housekeeping (Positivkontrolle). Die Uptake-Kontrolle ist eine stets fluoreszierende Sonde, mit der die Fähigkeit der Zelle, die Sonden aufzunehmen, bestimmt werden kann. Die Verwendung dieser Kontrolle ist wichtig, da hier der zelleigene Endozytosemechanismus zum Einsatz kommt und die Sonden nicht von allen Zellen gleichermaßen aufgenommen werden.

Die Scramble-Sonde dient als Hintergrundkontrolle. Der an der Scramble-Kontrolle angehängte „Reporter“-Strang hat keine komplementäre Ziel-RNA im Genom von Säugerzellen oder eukaryotischen Zellen. Daher ist jegliche Fluoreszenz der Scramble-Kontrolle unspezifisch (z.B. Sondenabbau, inkomplettes Quenching) und dient als Hintergrund-Fluoreszenz. Eine Housekeeping-Gensonde (z.B. GAPDH, ß-Actin) dient als positive Kontrolle dafür, dass die SmartFlare™ Sonden eine spezifische Genexpression in einer bestimmten Zellpopulation detektieren können.

Bild 3. B) Die Detektion von mRNA auf Einzelzellebene mithilfe von SmartFlare™-Sonden ermöglicht eine Identifizierung abweichender Populationen, die mittels qRT-PCR nicht detektierbar sind.

Heterogene Krebszellpopulationen
Die Heterogenität von Krebszellen ist ein bedeutendes Hindernis bei der Entwicklung und Verabreichung wirksamer Therapien. Bei der Untersuchung der mRNA-Expression in heterogenen Zellpopulationen hat der Vergleich auf Einzelzellebene gegenüber der RNA-Analyse auf Populationsebene einen wichtigen Vorteil.

Die quantitative RT-PCR kann in heterogenen Zellproben nicht zwischen Subpopulationen mit hoher und niedriger Expression unterscheiden (Bild 3a). Die Brustkrebs-Zelllinie MCF-7 weist zum Beispiel keine bzw. eine niedrige Expression von IL-6 auf, während die Zellinie MDA-MB-231 eine hohe Expression zeigt. Wenn unterschiedliche Anteile dieser Zellen gemischt werden, ändert sich das RNA-Expressionsprofil entsprechend. Bei der Analyse unbekannter heterogener Zellpopulationen kann der Wissenschaftler nicht unterscheiden, ob die Profiländerung auf eine sehr starke Expressionsänderung einer kleinen Subpopulation oder auf eine sehr geringe Expressionsänderung der gesamten Population zurückzuführen ist. Dagegen detektieren SmartFlare™-Sonden die Expression auf Einzelzellebene und ermöglichen somit die Identifizierung verschiedener Zellpopulationen, die mittels qRT-PCR nicht erfasst werden (Bild 3b). Die Detektion von mRNA-Expression auf Einzelzellebene ist daher eine wertvolle Methode zur Untersuchung heterogener Zellpopulationen.

Bild 4. A) Die c-MYC-mRNA-Expression nimmt während der Monozytendifferenzierung ab.

Monozyten-Differenzierung
Die mRNA-Detektion in lebenden Zellen ist auch sehr hilfreich zur dynamischen Untersuchung der Zelldifferenzierung. THP-1-Monozyten zeigen eine hohe Expression von c-MYC-mRNA. Diese Zellen wurden mit Phorbolmyristatacetat (PMA) behandelt, um ihre Differenzierung zu Makrophagen zu induzieren. Ihre c-MYC-Expression wurde mittels qRT-PCR und RNA-Detektion in lebenden Zellen mit SmartFlare™-Sonden an Tag 0 bzw. Tag 5 analysiert. Wie erwartet, ging während der Monozytendifferenzierung die c-MYC-mRNA-Expression an Tag 5 bedeutend zurück, was dem Zeitraum entspricht, den diese Zellen zur Differenzierung benötigen (Bild 4a).

Zellmorphologie und RNA-Expression können mithilfe der SmartFlare™-Sonden simultan beobachtet und dynamisch überwacht werden (Bild 4b). Dabei ist jedoch auch die Möglichkeit zu berücksichtigen, dass die Zelle weiterhin mRNA exprimiert, jedoch das Nanopartikel nach der Differenzierung nicht länger aufnimmt. Die Uptake-Kontrollsonden zeigen aber, dass sich die Aufnahme des Nanopartikels fünf Tage nach der PMA-Behandlung nicht geändert hat und bestätigen damit, dass die c-MYC-mRNA-Expression während der Differenzierung abnimmt (Bild 4c).

Bild 4. B) Dynamische Überwachung der mRNA-Expression und morphologischer Veränderungen.

Pluripotente Stammzellen
Die erfolgreiche Erzeugung induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS-Zellen) ist sowohl für die Forschung als auch für klinische Anwendungen von entscheidender Bedeutung. Die Identifizierung vollständig reprogrammierter iPS-Zellen kann jedoch schwierig sein und erfordert oftmals eine Fixierung und somit die Zerstörung der Zellen. SmartFlare™-RNA-Detektionssonden wurden erfolgreich zur Detektion der Pluripotenzgen-Expression in lebenden embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen eingesetzt [2].

Spezifische SmartFlare™-Sonden für GAPDH, NANOG und GDF3 ermöglichten eine zuverlässige Detektion der Genexpression in humanen, murinen und porcinen iPS-Zellen. Parallel dazu wurde eine qRT-PCR-Analyse durchgeführt, um die Expression dieser Gene in iPS-Zellen aller drei Spezies zu bestätigen. Die Anwendung der Sonden hatte weder Auswirkungen auf die Protein- oder mRNA-Expression noch auf die Zellproliferation.

Bild 4. C) Die c-MYC-mRNA-Expression ändert sich während der Differenzierung unabhängig von der Nanopartikelaufnahme der Zellen.

Die Sonden wurden als Echtzeit-Screeningwerkzeug eingesetzt, um reprogrammierte iPS-Zellen aus murinen Schwanzspitzenfibroblasten anhand ihrer Fluoreszenzintensität in situ zu identifizieren. Murine Schwanzspitzenfibroblasten wurden mit dem murinen STEMCCA™-Vektor (Merck Millipore) transduziert, der alle vier klassischen Yamanaka-Reprogrammierungsfaktoren enthält. Doxycyclin wurde ab Tag 2 zugegeben, und die Zellen wurden an Tag 3 auf einer Nährzellschicht aus murinen embryonalen Fibroblasten ausgesät. An Tag 9 hatten sich Kolonien gebildet, und es wurden NANOG- oder GDF3-spezifische SmartFlare™-Sonden zugegeben. An Tag 10 wurden einzelne Kolonien mit starker oder schwacher Fluoreszenz visuell unter dem Mikroskop identifiziert, die an Tag 11 in ein neues Nährmedium überführt und subkultiviert wurden. Nach dem zweiten Passagieren dieser Zellen wurde die Pluripotenzgen-Expression beurteilt.

Die aus diesen Studien erhaltenen Daten zeigen, dass NANOG ein zuverlässiger Marker für die Identifizierung vollständig reprogrammierter iPS-Zellen ist. Diese Schlussfolgerung wurde durch eine weitere Beurteilung in nachfolgenden Differenzierungsexperimenten mit embryonalen Stammzellen als Kontrolle bestätigt. NANOG-selektierte Kolonien exprimierten Endoderm-, Ektoderm- oder Herzmesoderm-spezifische Marker in einem Maß, das mit dem Expressionsniveau differenzierter Stammzellen zu vergleichen ist. Außerdem ermöglichen diese Klone eine Identifizierung kardialer Progenitoren anhand ihrer GFP-Fluoreszenz. Kolonien mit einer hohen NANOG-spezifischen Fluoreszenz erzeugten eine stark erhöhte Fraktion kardialer Progenitoren bei ihrer Differenzierung. NANOG-spezifische SmartFlare™-Sonden kön- nen daher zur Identifizierung vollständig reprogrammierter muriner iPS-Zellen in Echtzeit und in situ eingesetzt werden.

Schlussfolgerung
SmartFlare™-RNA-Detektionssonden können für jede Ziel-mRNA und jeden Zelltyp zur zuverlässigen Detektion von Genexpression in einzelnen lebenden Zellen ohne Manipulation der Zielzelle angewendet werden. Diese Sonden sind nicht toxisch und haben weder Auswirkungen auf die Protein- oder mRNA- Expression noch auf die Zellproliferation. Wichtig ist dabei, dass die mit SmartFlare™- Sonden behandelten Zellen intakt bleiben und für Funktionsstudien in nachfolgenden Experimenten eingesetzt werden können. Diese Technologie ist eine leistungsstarke Methode zur dynamischen Untersuchung heterogener Zellpopulationen und der Zelldifferenzierung, zur Identifizierung reprogrammierter iPS-Zellen und zur Funktionsbeurteilung von RNA-Biomarkern.

Anmerkung
Dieser Artikel basiert auf einem GenomeWeb-Webinar der beiden Autoren sowie auf einem Artikel in Stem Cells [2], bei dem Dr. Lahm ein Mitverfasser war.

Literatur
[1] Seferos, DS, Giljohann DA, Hill HD, Prigodich AE, and Mirkin CA. Nano-flares: Probes for Transfection and mRNA Detection in Living Cells. J Am Chem Soc. 2007 (129) 50 15477 -15479
[2] H, Doppler S, et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells 2014;DOI: 10.1002/stem.1872.

PD Dr. rer. nat. Harald Lahm, Leiter des Labors für Molekular- und Zellbiologie der Experimentellen Chirurgie Deutsches Herzzentrum München

Autoren:
PD Dr. rer. nat. Harald Lahm
Leiter des Labors für Molekular- und Zellbiologie der Experimentellen Chirurgie Deutsches Herzzentrum München

Don Weldon, R&D Manager, EMD Millipore Corporation

Don Weldon
R&D Manager
EMD Millipore Corporation
Tel. +1 951 514 4566
E-Mail: don.weldon@emdmillipore.com

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