Der HPLC-Tipp im April

Der Detektor als Ursache für mangelnde Reproduzierbarkeit der Peakfläche

Dr. Stavros Kromidas, Saarbrücken

Der Fall

Nehmen wir an, Sie haben folgendes Problem: Sie stellen bei Wiederholmessungen eine schlechte Reproduzierbarkeit der Peakfläche fest oder Sie erhalten bei der Methodenübernahme/dem Methodentransfer einfach eine andere Peakfläche als vorgegeben. Sie können mehrere mögliche Ursachen ausschließen (Autosamp- ler, Stabilität der Probe, Fluss, Memory-Effekt etc.). Es scheint also, dass der Detektor das Problem ist. Woran könnte es nun liegen?


Die Lösung

Gehen wir davon aus, dass Sie selbstverständliche Sachen überprüft haben bzw. bei Bedarf die wichtigsten Maßnahmen bereits ergriffen haben, z.B: Das Gerät ist natürlich qualifiziert, die Lampenenergie ist okay, die Kalibriergerade mit einer SST-Lösung sieht gut aus, die Zelle ist gespült, die Platinen sind nicht korrodiert, die Temperatur ist stabil usw. Es folgen nun stichwortartig Beispiele von Ursachen für die häufigsten Detektoren, die in der HPLC für quantitative Analysen verwendet werden: UV-Vis/DAD, FLD und RI. Die LC/MS-Kopplung betrachte ich eher als ein Tool für qualitative Informationen. Als Beispiel eines Aerosol-Detektors werde ich auf Corona (CAD) eingehen.

UV-Vis bzw. DAD

 Schmutz (Staub, Dämpfe etc.) im Detektor führt zu Streulicht, Streulicht führt zur Abnahme des linearen Bereichs. Merke: Bereits bei einem Streulicht von 0,01 % haben wir nach 3 Absorbanz keine Linearität mehr (Info:

Anzeige

Dr. Jochen Hallmann,

Hellma Analytics). Wegen des unterschiedlichen Streulichtes weisen UV-Vis und DAD unterschiedliche lineare Bereiche auf – wichtig bei Methodenadaptionen.

"Bei jedem Gerät haben wir bei der Einstellung der Wellenlänge ein "Spiel" von ± 2 nm (mindestens). Bereits die Differenz von ± 1 nm kann bei einer ungünstigen Wellenlänge und unterschiedlichen UV-Spektren zweier Substanzen zu einer merklichen Differenz in der Peakfläche führen.

 Beim Methodentransfer differieren womöglich die eingestellten Parameter, betrachten wir hier stellvertretend zwei wichtige Größen beim DAD:

1. Bandbreite ("Bandwidth"): Bei einer unterschiedlich eingestellten Bandbreite (z.B. 4 und 12 nm) ergibt sich ein anderes Rauschen und somit eventuell ein anderes Peak/Rauschen-Verhältnis. Und jenes kann den Variationskoeffizienten beeinflussen, da bei der Integration abhängig vom Rauschen Peakanfang und Peakende unterschiedlich reproduzierbar gefunden wird. Das habe ich mehrmals bei HPLC- und UHPLC-Messungen feststellen müssen.

2. Spalt ("Slit"): Weiter Spalt: Gute Nachweisgrenze (höheres Signal), geringes Rauschen. Enger Spalt: genau umgekehrt.

 DAD: Eine Referenzwellenlänge „zu“ nah an der Messwellenlänge kann zu einer Abnahme der Peakfläche führen.

Folgende Probleme seien hier nur kurz erwähnt: Bei einem UV-Detektor, der lange nicht im Betrieb gewesen ist, kann das Fett an dem Gittersitz ranzig werden und die Wellenlängengenauigkeit ist nach x Monaten nicht gegeben, was während der Qualifizierung der Fall gewesen ist; die Farbe aus dem Gehäuse kann auf den Spiegeln sublimieren; schließlich sind alkalische Eluenten nicht nur für die Säule problematisch…


Fluoreszenzdetektor (FLD)

 Ein bestimmter Hersteller hat – mit dem Ziel einer höheren Energie (er verwendet ein kleines Zellvolumen) – eine zusätzliche Hg-Lampe eingebaut. Dies führt zu einer falschen Wellenlänge bei der Extinktion/Emission abhängig von der Substanz. Ergebnis: Es ergibt sich nicht nur eine andere (falsche) Peakfläche beim Methodentransfer im Falle eines Gerätes von einem anderen Hersteller, sondern auch bei Vergleichsmessungen mit einem anderen Gerät des gleichen Herstellers.

 Unterschiedliche Effektivität beim Entgasen kann zu unterschiedlichen Peakflächen führen – und die Abnahme der Peakfläche ist nicht für alle Peaks im Chromatogramm einheitlich!

Brechungsindex-Detektor (RI)

Wenn ein Analyt als Salz oder lediglich als Hydrochlorid eluiert, kann neben dem üblichen positiven Signal der Substanz eventuell auch ein negatives Signal – eben des Salzes – auftreten. Da das Signal des Analyten selbst in der Regel wesentlich größer ist, wird der negative Peak kompensiert, man stellt nur eine andere Peakfläche fest – falls die Retentionszeiten ähnlich sind. Die festgestellte Differenz der Peakfläche ist nun abhängig von der Konstitution der Probenlösung und das kann ein Problem sein, falls jene sich ändert (pH-Wert, Konzentration, Lösungsmittel).


Corona (CAD)

 Im unteren Konzentrationsbereich herrscht keine Linearität, vielmehr wird ein konkaver Zusammenhang zwischen Signal und Konzentration festgestellt (Info:

Dr. Michael Pfeffer,

Bayer AG), Ergebnis: Kleine Peaks erscheinen im Vergleich zu großen Peaks verhältnismäßig größer. Das ist zwar positiv, wenn man im Spurenbereich Verunreinigungen noch detektieren möchte, die Zuverlässigkeit jedoch der quantitativen Aussage ist vom Konzentrationsbereich abhängig.

 Das Signal ist stark von der mobilen Phase abhängig, d.h: Je nach Eluentenzusammensetzung, Gradientensteigung, Salzkonentration und pH-Wert erscheinen die Peaks kleiner/größer.

Das Fazit

Ein qualifizierter Detektor bedeutet lediglich: Das Gerät war zum Zeitpunkt der Qualifizierung technisch okay. Ob bei diesem Gerät die Reproduzierbarkeit der Peakfläche bei diesen chromatographischen Bedingungen und diesen Einstellungen auch gegeben ist, ist eine ganz andere Frage. Es sollte mit Hilfe einer realen Probe überprüft werden, in wieweit bei welchen Einstellparametern welche Reproduzierbarkeit „hier und jetzt“ erreicht wird. Ist diese nicht die erwartete/erhoffte, könnten weiter oben genannten Ursachen in Frage kommen.

©

by

Stavros Kromidas


www.kromidas.de

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige

HPLC-Tipp

Sehr kleine Peaks – was kann ich tun?

Nehmen wir an, Sie müssen Komponenten in einer extrem geringen Konzentration quantifizieren – die Peaks sind einfach sehr klein. Es geht also im vorliegenden Fall vordergründlich nicht um eine gute Auflösung, es geht um eine gute Detektierbarkeit.

mehr...
Anzeige