HPLC-Tipp

Warum macht nur ein Peak Probleme? (I)

Sie wenden eine Routinemethode an, alle Peaks im Chromatogramm verhalten sich wie von Ihnen erwartet: Die Retentionszeit bleibt konstant, die Peakfläche ebenso und die Peakform ist soweit ok. Nur ein (oder zwei) Peak(s) macht(en) Probleme, z.B. nur dieser eine Peak ist breit und/oder seine Fläche ändert sich permanent und/oder eventuell ändert sich auch seine Retentionszeit. Was kann die Ursache sein?

Dr. Stavros Kromidas, Breslauer Str. 3, 66440 Blieskastel, www.kromidas.de

Wir beginnen mit dem, was nicht sein kann: Nachdem die übrigen Peaks sich „anständig“ verhalten, können wir alle Substanz-unspezifischen Faktoren (die ja alle Peaks betreffen würden – mal stärker, mal schwächer, aber eben alle) ausschließen: Fluss, %B im Eluenten, Temperatur, Packungsqualität, weitgehendst auch die „Chemie“ der Oberfläche der stationären Phase (mehr bzgl. des letzten Punktes im nächsten HPLC-Tipp!). Im vorliegenden Fall handelt es sich offensichtlich um eine Substanz-spezifische Ursache, also um ein Problem, das sich nur für die betreffende Substanz als solches erweist.

Liebe Leser, ich will Sie weder beunruhigen noch mit unzähligen Fakten bombardieren, aber es gibt in der Tat eine Reihe von Ursachen, die zu Problemen bei der Trennung/der quantitativen Bestimmung einer bestimmten Substanz oder einer bestimmten Substanzklasse führen kann. Also betrachten Sie bitte nachfolgende Ausführungen ebenso wie die im nächsten HPLC-Tipp nicht als „Kassandra-Rufe“, sondern überlegen Sie sich – sollten Sie auf einen derart gelagerten Fall stoßen – , ob eine der aufgeführten Ursachen für Sie infrage kommt. Grundsätzlich: Sollte das Problem plötzlich aufgetaucht sein, versuchen Sie zu klären, ob eine unbewusste Änderung an den Utensilien (Filtermaterial, Wägehütchen, Material der Pipette, etc. s. weiter unten) oder an den chromatographischen Bedingungen (andere Pufferstärke, steiler Gradient, andere Mischkammer, etc.) vorgenommen wurde. Und schließlich: Sind im Falle eines Methodentransfers vielleicht Unterschiede in der Hardware-Anordnung (z.B. Hoch- vs. Niederdruckgradient), in der Hardware (z. B. PEEK- vs. Stahlkapillare) oder in den Modulen (z.B. Rohluft- vs. Kontaktofen) vorhanden? Heute wollen wir uns mit den Materialien beschäftigen, im April-Tipp gehen wir auf die Chemie/den Gradienten ein.

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Memory-Effekt durch Physisorption (Adhäsion)
Bestimmte Analyte zeigen eine erhöhte Affinität zu allerlei Oberflächen. Dies führt dazu, dass manch´ eine Komponente dort durch Physisorption (Adhäsion) ganz oder auch nur teilweise sorbiert wird. Das Ergebnis ist ein Memory-Effekt. Wenn dies in der Anlage geschieht und während der Messungen dann zwischendurch ein Spülschritt oder eine Flussänderung erfolgt, kann der Analyt ganz oder teilweise heruntergespült werden. Jener kann jetzt als Geisterpeak erscheinen, oder aber er koeluiert mit jenem „neuen“ Analyten, der gerade injiziert wurde – das Ergebnis ist eine erhöhte Peakfläche. Es liegt auf der Hand, dass diese Erscheinungen kaum reproduzierbar, geschweige denn vorhersagbar sind.

Nun folgt beispielhaft die Nennung analytischer „Werkzeuge“ und Stellen in einer HPLC-Anlage, an denen ein Analyt bei entsprechenden Eigenschaften von der Einwaage bis zur Detektion haften bleiben kann – geben Sie bitte Acht, sollte hier etwas (unbewusst) geändert worden sein:

  • Spatel, Wägehütchen (Keramik, Aluminium, Stahl, Glas, Kunststoff?).
  • Pipette (Glas – welches Glas, Kunststoff, „Lösemittel geeignet“?).
  • Filtermaterial (Beschaffenheit, Charge).
  • Injektionsnadel (Aufbau, Material – Stahl/Messing – Kunststoffummantelung ja/nein).
  • Autosampler-Dichtung (Material, Alter, neue Charge?).
  • Vials (Beschaffenheit der (Glas-)Oberfläche, weiss/braun).
  • Septen (Material, dunkel-/hellrote Septen, „Sandwich-Septen“, vorgeschlitzte Septen).
  • Stahl- vs. PEEK-Kapillaren, ebenso Material der Fittings.

Eher selten ein Problem, dennoch evtl. überlegenswert: Geometrie und Material der UV-Zelle. Memoryeffekte werden auch an den Interfaces von Aerosoldetektoren (LSD, Corona) beobachtet.

Das Fazit
Die bei der Probenvorbereitung und in einer HPLC/UHPLC-Anlage eingesetzten Materialien können das Ergebnis massiv beeinflussen. Diese Problematik war mir in dieser Tragweite – offen zugegeben – bis vor Kurzem nicht bewusst. Für interessierte Leser daher folgende Info: Eine detaillierte Behandlung dieses Themas findet sich in [1].

Literatur
[1]
Tobias Fehrenbach und Steffen Wiese, „Materialien in HPLC und UHPLC – was für welchen Zweck“ in S. Kromidas (Hrsg.) „Der HPLC-Experte II – so nutze ich meine HPLC/UHPLC optimal!“, Wiley-VCH-Verlag, ISBN 978-3-527-33838-2.

Ihr Stavros Kromidas

© by Stavros Kromidas
http://www.kromidas.de

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