Autoimmunerkrankungen

Autoantikörper-basierte Diagnostik

Die Autoantikörper-basierte Diagnostik stellt bei Autoimmunerkrankungen einen Schlüssel zur Diagnose und Behandlung dar. Eine Änderung des Antikörperprofils wurde aber ebenso für andere Erkrankungen gezeigt – und bietet neue Möglichkeiten zur minimal-invasiven Diagnostik.
© © AIT/Foto: Martin Lusser

Seit Jahrzehnten werden immunologische und serologische Tests in der Diagnostik eingesetzt. Diese basieren auf dem Nachweis von Antikörpern im menschlichen Blut gegen ein Antigen körperfremder Herkunft (Bakterien, Viren, Allergene), gegen ein körpereigenes Protein (z. B. bei Autoimmunerkrankungen) oder gegen ein krankheitsbedingt verändertes Biomolekül (z. B. Tumor-Autoantigen Plaques). Die Messung von Antikörpern gegen ein Antigen kann mit relativ einfachen Messverfahren, z. B. einem ELISA, durchgeführt werden. Diese Verfahren sind gut etabliert und wurden in unterschiedlichste Formate implementiert. Im Folgenden werden aktuelle Entwicklungen und Trends in der Autoantikörper-basierten Diagnostik beschrieben.

1. Trend zur Multiplex-Analyse

Der Trend geht deutlich hin zur Multiplex-Analyse, wobei die Seroreaktivität parallel gegen verschiedene Antigene analysiert wird. Je nach Methode (ELISA, Lateral-flow-Teststreifen, Beads, Microarrays) sind die Antigene auf einer entsprechenden Trägeroberfläche immobilisiert. Die Analysen auf diesen Oberflächen können mit sehr wenig Probenmaterial durchgeführt werden. Üblicherweise wird Serum etwa 1 : 100 verdünnt, die Antikörper binden im Test an das immobilisierte Antigen und werden mit einem Detektionsantikörper analysiert. (Eine interessante nicht-invasive Alternative zum Blut stellt Speichel zur Detektion dieser Antikörper dar und könnte in der Arztpraxis z. B. zur einfachen Bestimmung des Impfschutzes zum Einsatz kommen.)

Anzeige

2. Mit Screening-Methoden relevante Antigene suchen

Obwohl die Bestimmung von Antikörpern lange etabliert ist, wurde (im Vergleich zu den DNA-basierten Diagnostik-Anwendungen) in diesem Bereich relativ wenig Neues entwickelt. Um Antigen-Marker zu finden, ohne a priori die Targets einzuschränken, werden Screening-Verfahren wie SEREX oder SERPA eingesetzt. Diese Verfahren laufen meist über viele Monate und bedingen, dass etwaige neue Kandidaten in Expressionsklonen zur Darstellung der Proteine generiert und bereitgestellt werden müssen. Mit den aus den Expressionsklonen rekombinant exprimierten Proteinen können weitere Analysen durchgeführt werden. Heutzutage stellen Protein- und Peptid-Microarrays eine effiziente Alternative dar, um neue Marker zu finden.

Protein-Arrays: Die Microarray-Technologie wurde vor etwa 20 Jahren vorwiegend im DNA-Bereich entwickelt und an die Bedürfnisse zur Immobilisierung von Proteinen angepasst. Dazu werden die Protein-Antigene mit Expressionsklonen rekombinant exprimiert und über spezifische Affinity-Tags gereinigt. Tausende Proteine werden dann in Pico- bis Nanoliter-Tröpfchen auf Glasträger gedruckt („microarray spotting“), und so werden Protein-Microarrays produziert.

Bild 1: A) Schematische Darstellung der synthetisierten Peptide auf einem Microarray, welche mithilfe eines Tiling-Ansatzes berechnet wurden. In der gezeigten Abbildung wurde ein Protein in Peptide unterteilt, die jeweils eine Länge von 16 Aminosäuren aufweisen und mit 15 Aminosäuren überlappen. B) Darstellung der IgG-Signale (y-Achse) über die Proteinsequenz (x-Achse) der Peptid-Microarray-Daten. Jede rote Linie zeigt eine gemessene Patientenprobe, die einen definierten Grenzwert signifikant gegenüber den Kontroll-Proben (Signal-Hintergrund in grau) überschritten hat. Aufeinanderfolgende signifikante Peptide (rote Kästchen entlang der X-Achse) zeigen differenziell reaktive Epitope. © AIT

Heutzutage können Protein-Arrays mit mehr als  30 000 Spots mittels „Tintenstrahldruck“-Technologie auf funktionalisierte Glas-Objektträger gedruckt werden und stellen eine gute Basis zur Identifikation neuer Biomarker dar. Die Herstellung dieser Microarrays ist sehr aufwändig und wird von wenigen Forschungsgruppen und einigen Firmen durchgeführt, die solche Protein-Arrays auch kommerziell anbieten.

Peptid-Arrays: Eine Alternative zu den mit viel Aufwand herzustellenden Protein-Arrays sind Peptid-Arrays. Vergleichbar mit dem Wandel von cDNA zu Oligo-Arrays in der DNA-Welt können Peptide heutzutage effizient synthetisiert und damit Microarrays gedruckt oder direkt in-situ auf Glasträgern synthetisiert werden, um Peptid-Microarrays herzustellen.

Peptid-Arrays können mittels In-situ-Synthese mit bis zu sechs Millionen Peptiden pro Array bestückt werden. Diese sind somit vergleichbar mit den Dichten von kommerziellen DNA-Arrays. Allerdings sind hier nur wenige Forschungsgruppen aktiv, so dass die Kommerzialisierung und weitere Verbreitung bzw. der Zugang zu hochdichten Peptid-Arrays beschränkt ist.

Über die Selektion von diagnostischen Biomarkern hinaus erlaubt die Analyse der Gesamtheit der Antikörperprofile bzw. der differenziell reaktiven Peptide und Proteine in Pathway-Analysen die Aufklärung biologischer und molekularer pathologischer Zusammenhänge. Dazu eignen sich Analyse-Programme wie DAVID, Reactome, WebGestalt oder Ingenuity Pathway Analysis.

3. Peptid-Array-Design 

Auf Peptid-Microarrays können lineare Protein-Sequenzabschnitte dargestellt werden (die Darstellung von Sekundär- und Tertiär-Strukturen ist kaum oder nur sehr eingeschränkt möglich). Dabei wird das Protein in-silico in 12 bis 16 Aminosäuren lange Peptide geteilt und z. B. ein gesamtes Proteom auf einem Microarray abgebildet. Die Selektion der nicht-redundanten Peptide aus Proteinsequenzen wird am Computer durchgeführt und kann durch das Setzen der geeigneten Parameter adaptiert werden.

Bild 2: Die Autoren fassen ihre Labor- und Bioinformatik-Tools in einer Pipeline (PepPipe) zusammen, um Protein- und Peptid-basierte Analysen durchzuführen. Damit können z. B. Peptid-Antigene für die Diagnostik und für die Therapie effizient definiert werden. Teile dieser Arbeiten werden derzeit im Rahmen des Förderprojekts „Research Studios Austria-FFG (Projekt-Nr: 859182) etabliert und anhand von Rheumatoider Arthritis, ­Colonadenom und Lungenkarzinom etabliert und exemplarisch angewendet. © AIT

Epitope-Mapping und Peptidom-Array: Eine Ergänzung der experimentellen Analyse bieten Algorithmen, die lineare und strukturelle Epitope berechnen und vorhersagen können, um diese selektiv in die Analyse einzubeziehen. Um die Anzahl der benötigten Peptide gegebenenfalls zu reduzieren, können z. B. in früheren Experimenten als nicht-reaktive Peptidsequenzen identifizierte Motive aus dem Design entfernt werden. Wenn Proteine zur Gänze auf solchen Peptid-Microarrays dargestellt sind, ist ein Epitope-Mapping möglich, bei dem die Reaktivität der unterschiedlichen Abschnitte mit Antikörpern untersucht wird. Dabei können auch mutierte Varianten der Sequenzen bewertet und zur Wild-Typ-Sequenz in Relation gestellt werden.

Durch die hohe Dichte der Microarrays sind Analysen von gesamten Proteomen, also die Abbildung aller Protein-Sequenzen eines Organismus durch kurze Peptide, mit sogenannten „Peptidom-Arrays“ möglich. Zusätzlich können die Citrullinierung von Arginin oder die Carbamylierung von Lysin-Resten, Glykosylierungen, Phosphorylierungen sowie weitere post-translationale Modifikationen in das Design sowie in die Synthese und Peptid-Array-Analyse miteinbezogen werden. 

4. Probenqualität und Bestätigung von Biomarker-Kandidaten 

Ein wichtiger Aspekt in der Biomarker-Entwicklung ist die zugrunde liegende Qualität der Proben. Je nach Art des zu untersuchenden Analyten können Parameter wie das verwendete Blutabnahmesystem, die Zeitspanne der Probennahme bis zur Verarbeitung und dem Einfrieren der Probe und die Probenvorbereitung großen Einfluss auf die Messergebnisse haben.

Besonders in der Biomarker-Entwicklung sind standardisiert gesammelte Probenkohorten unabdingbar, um den Einfluss von nicht-krankheitsbedingten Faktoren auf die Messdaten zu minimieren. Dazu hilft die Zusammenarbeit mit klinischen Einrichtungen und Biobanken, die eine standardisierte Probensammlung implementiert haben. Je mehr Patienten in solche Studien eingeschlossen werden können, desto besser – dabei spielt die Vergleichskohorte an nicht-erkrankten Personen (deren Proben nach denselben Standards gesammelt werden müssen) eine genauso große Rolle und darf nicht vernachlässigt werden. Longitudinal über einen längeren Zeitraum von denselben Personen gesammelte Proben können z. B. zur Entwicklung von Biomarkern zur Krankheitsfrüherkennung, dem Ansprechen auf die Therapie oder zum Therapiemonitoring herangezogen werden. Die Sammlung und Verfügbarkeit von klinischen Proben ist der Schlüssel, um diagnostische Fragestellungen zu lösen. Internationale Biobanken-Initiativen und -Netzwerke tragen diesem Bereich bereits Rechnung.

Probenvolumina: Die meisten Analysen können heute mit kleinen Probenmengen durchgeführt werden. Das gilt z. B. für die Antikörper-basierten Fragestellungen, die mit unserer Pipeline bearbeitet werden: Sie kommen – in unterschiedlich skalierten Formaten – i. d. R. mit wenigen Mikrolitern aus. So führen wir am AIT z. B. aus 15 µl Plasma oder Serum ein breites Screening nach neuen Protein- und Peptidmarkern durch. Eine Messung kann mit verdünnten Plasma- und Serumproben direkt durchgeführt werden. Unsere Erfahrung hat jedoch gezeigt, dass durch Verwendung von gereinigten Antikörpern störende Matrixeffekte minimiert werden und der linear-dynamische Messbereich vielfach erweitert wird. Damit können geringe Unterschiede besser definiert und robust gemessen werden. 

Kleine Testformate für Biomarker-Selektion: Nach einem ersten breiten Screening zur Identifikation von Biomarker-Kandidaten (z. B. zur Differenzierung zwischen „gesund und krank“) mit großen Protein- oder Peptid-Arrays gilt es, die gefundenen Marker auf kleineren Test-Formaten zu implementieren und mit vielen Patientenproben zu bestätigen, um die besten Marker zu selektieren. Als Methoden für diese gezielten Tests bieten sich sogenannte maßgeschneiderte targeted Microarrays oder Bead-Arrays an, die die parallele Analyse von einigen hundert Antigenen erlauben.

Wir haben beide Formate in unserer Pipeline implementiert und wenden – abhängig von der Anzahl an Peptiden und Proteinen – das am besten geeignete Format an. Wie nach einem Baukastenprinzip können hier die relevanten Analyten, die als neue Biomarker dienen könnten, zusammengestellt und in weniger komplexen Tests effizient validiert werden. In diesem Schritt ist es vorteilhaft das finale Testformat bereits im Blick zu haben, in welches dann das Antigenset mit der besten klinischen Performance implementiert wird. Damit können die so selektierten Marker in kommerzielle Kits wie z. B. ELISA, Luminex-Assays, Streifentest etc. für eine klinische Validierung integriert werden. 

5. Anwendungsfelder und praktische Bedeutung für die Klinik

Einleitend wurde die Bedeutung von Antikörperanalysen bei Autoimmunerkrankungen bereits erwähnt. Diese Analytik ist ebenso in der Diagnostik von Allergien und Infektionserkrankungen nicht wegzudenken. Für Tumorerkrankungen finden sich bereits erste Tests in klinischer Verwendung. Antikörper gegen einzelne Antigene oder Veränderungen im Antikörperprofil sind ebenso für neurodegenerative und inflammatorische Erkrankungen sowie für Herz-Kreislauf-Erkrankungen bekannt. Da das Immunsystem generell bei Erkrankungen aktiv reagiert, kann dies auf Antikörperebene bestimmt werden.

Tabelle 1: Einsatz der Antikörper-basierten Diagnostik

Die verschiedenen, im Körper präsenten Antikörper-Klassen spielen bei vielen Erkrankungen und deren Behandlung eine wichtige Rolle: von der Infektionsdiagnostik (IgM, IgG, IgA) über die Allergiediagnostik (IgE) und allergenspezifische Immuntherapie (IgE, IgG) – und auch in der Onkologie (Immunonkologie). Die Bestimmung der Immunantwort ist bei diversen Therapien ein geeignetes Maß zur Bewertung des Therapieansprechens und kann für die Detektion von Unverträglichkeiten verwendet werden. Da Antikörper gegen Therapeutika aber auch deren Wirkung abschwächen können, kann dieses Verfahren auch zum Therapiemonitoring eingesetzt werden.

Fazit

Autoantikörper-basierte Analysen haben ein breites potenzielles Anwendungsspektrum: von einfachen Home-use-Tests zur Bestimmung von Antikörpern aus nicht-invasivem Probenmaterial (z. B. zur Prüfung des Impfstatus oder zum Nachweis von Infektionserkrankungen) bis hin zum Nachweis eines Therapieansprechens. Vor allem bei der Entwicklung neuer Medikamente und Therapeutika spielen Autoantikörper-basierte Analysen eine wichtige Rolle.

AUTOREN

Regina Soldo MSc
Dr. Stephan Pabinger
PD Dr. Andreas Weinhäusel (andreas.weinhaeusel@ait.ac.at)

Molecular Diagnostics
www.ait.ac.at/solutions/molecular-diagnostics
AIT Austrian Institute of Technology GmbH, Wien
www.ait.ac.at

Veröffentlichungen der Autoren zum Thema:

1. Rosskopf S et al. (2015). The pre-analytical processing of blood samples for detecting biomarkers on protein microarrays. J. Immunol. Methods 418, 39–51.

2. Brezina S et al. (2015). Immune-Signatures for Lung Cancer Diagnostics: Evaluation of Protein Microarray Data Normalization Strategies. Microarrays 4, 162–187.

3. Luna-Coronell JA et al. (2016). The prostate cancer immunome: In silico functional analysis of antigenic proteins from microarray profiling with IgG. Proteomics 16, 1204–1214. doi:10.1002/pmic.201500378.

4. Weinhaeusel A et al. (2017). Method of detecting colitis ulcerosa. European Patent Application EP17172184; filed 22-5-2017.

5. Johana A et al. (2018). The Immunome of Colon Cancer: Functional In Silico Analysis of Proteins Deduced from IgG Microarray Profiling. Genomics, Proteomics & Bioinformatics, 2018 Mar 2, 73–84. doi: 10.1016/j.gpb.2017.10.002.

6. Ponce M et al. (2018). Preventive sublingual immunotherapy with House Dust Mite extract modulates epitope diversity in pre-school children. Allergy; Article. DOI: 10.1111/all.13658.

Anzeige

Das könnte Sie auch interessieren

Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige
Anzeige

Newsletter bestellen

Immer auf dem Laufenden mit dem LABO Newsletter

Aktuelle Unternehmensnachrichten, Produktnews und Innovationen kostenfrei in Ihrer Mailbox.

AGB und Datenschutz gelesen und bestätigt.
Zur Startseite