Das Problem: Die gängigen Markierungsmethoden, zum Beispiel Immunfärbungen mit einem Antikörper, verursachen einen Abstandsfehler von mehr als 10 nm. Dadurch verhindert die Größe der Markierungsmoleküle eine Auflösung im Nanometerbereich. Die Ursache für die sub-10 nm Auflösungsbarriere war bisher nicht bekannt. „In unserer Publikation konnten wir nun erstmals zeigen, dass die Photoschaltraten (Blinking) der Farbstoffe zwischen einem An- und Aus-Zustand bei Abständen unterhalb von 10 nm aufgrund verschiedener Energietransferprozesse zwischen Farbstoffen stark beeinflusst wird. Hierdurch kommt es während den ersten Sekunden eines Experiments gehäuft zu An-Zuständen und damit verbunden zum schnellen Photobleichen der Farbstoffe, was ihre individuelle Lokalisation erschwert“, erklärt Sauer. „Die verringerte Lokalisationswahrscheinlichkeit der Farbstoffe resultiert daher in einer schlechteren strukturellen Auflösung, als man aufgrund der individuellen Lokalisationsgenauigkeit erwarten würde. Dies ähnelt einem Orchester, indem alle Instrumente zeitgleich am Anfang des Stücks ihre Beiträge spielen; es ist unmöglich die einzelnen Tonspuren herauszuhören.“

Zeitaufgelöste Fluoreszenzdetektion

Der Photoswitching-Fingerabdruck (Photoswitching Fingerprint) und die Fluoreszenzabklingdauer enthalten aber auch Information über die Anzahl der vorhandenen Farbstoffe und – aufgrund der Abstandabhängigkeit der Energietransferprozesse – auch Information über deren Abstände, ohne dass man die einzelnen Farbstoffe optisch auflösen kann. Durch den Einbau unnatürlicher Aminosäuren in multimere Membranrezeptoren, der Erweiterung des genetischen Codes (Genetic Code Expansion), mit anschließender bioorthogonaler Click-Markierung mit kleinen Fluoreszenz-Farbstoffen konnten die Würzburger Forschungsgruppen nun im nächsten Schritt aufzeigen, wie die spezifische ortsgenaue Markierung von Proteinen in Zellen ohne Abstandsfehler mit Sub-10-nm-Abständen gelingen kann. „Durch die Analyse der Photoswitching Fingerprints der multimeren Rezeptoren in der Plasmamembran konnten wir so erstmals Abstände zwischen Rezeptoruntereinheiten im Bereich von 5 – 7 nm in Zellen abschätzen und die Anzahl der markierten Untereinheiten bestimmen“, sagt Beliu.

Förderung
Die Studie wurde aus Mitteln des European Research Council (ERC, under the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme, grant agreement No 835102) und von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG SA829/19-1) gefördert.

Publikation
Photoswitching fingerprint analysis bypasses the 10 nm resolution barrier. Dominic Helmerich, Gerti Beliu, Danush Taban, Mara Meub, Marcel Streit, Alexander Kuhlemann, Sören Doose and Markus Sauer. Nature Methods, August 2022. doi.org/10.1038/s41592-022-01548-6

Quelle: Universität Würzburg